먼저 위 선암 세포를 TMEM200A Si-RNA로 transfection하고 이틀 동안 배양합니다. 그런 다음 웰에서 세포 배양 배지를 버리고 PBS 1mL로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다. 세포를 얼음 위에 놓고 150마이크로리터의 사전 냉각된 방사성 면역 침전 분석 용해 완충액을 추가합니다.
플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 부착 셀을 조심스럽게 분리하고 셀 용액을 사전 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 10분 동안 4G의 거듭제곱으로 올린 1.5 x 10의 세포 용해물을 원심분리하고, 상층액을 새로운 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단백질 함량을 측정하십시오.
각 샘플에서 30g의 단백질을 10%SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 젤을 80볼트에서 0.5시간 동안 작동시킨 다음 1.5볼트에서 120시간 동안 실행합니다. 다음으로, 1 내지 1.5시간 동안 300 밀리암페어의 일정한 전류로 겔로부터 단백질을 45 마이크로미터 PVDF 막으로 옮긴다.
PVDF 멤브레인을 셰이커에 각각 5분씩 3회 놓습니다. 흔든 후 단백질 면이 위로 향하도록 용기에 TBST를 추가합니다. 멤브레인을 차단 완충액에 넣고 실온에서 30분 동안 둡니다.
TBST로 멤브레인을 각각 10분씩 3회 세척합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1차 항체로 막을 배양합니다. TBST로 멤브레인을 3회 세척한 후 토끼 또는 마우스 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양한다.
그런 다음 ECL 기판을 PVDF 멤브레인에 30초 동안 추가하고 이미징 시스템을 사용하여 신호를 감지합니다. Si-RNA로 transfection된 위암 세포 HGC-27에서 TMEM200A의 효율이 non-transfection된 세포에 비해 현저히 감소했습니다. TMEM200A Si-RNA는 상피 중간엽 전이에서 관련 단백질을 현저히 억제하고 포스포이노시티드 3-키나아제 신호전달 경로에서 AKT의 인산화에 영향을 미쳤습니다.
