시작하려면 EVtrap 접근법을 사용하여 소변 샘플에서 분리된 세포외 소포체의 단백질체 및 포스포프로테옴 샘플을 준비합니다. 액체 크로마토그래피 시스템을 통해 갇힌 이온 이동성 ToF(Time-of-Flight) 질량분석기에 샘플을 주입합니다. 펩타이드를 15cm C18 컬럼으로 분리합니다.
단백질체학 분석의 경우, 300 - 1200 질량 대 전하 비율 및 0.6 - 1.50 1/노트의 이온 이동도 상수를 갖는 램프당 질량 범위로 dia-PASEF 방법을 사용하여 데이터를 획득합니다. 인산화체학 분석의 경우 dia-PASEF 수집 방법을 사용하여 데이터를 수집합니다. 램프당 질량 범위를 400에서 1550 사이의 질량 대 전하 비율로 설정하고 이온 이동도 상수는 0.6에서 1.50 1/노트입니다.
원시 파일을 단백질체 소프트웨어에 로드합니다. 호모 사피엔스 데이터베이스에서 검색 매개 변수를 설정합니다. [Digest Type]에서 [Specific]을 선택하고 [Enzymes]에서 [TrypsinP]를 선택합니다.
펩타이드 길이를 최소 7 및 최대 52로 정의하고 두 개의 누락된 절단을 허용합니다. 그런 다음 최대 변수 수정을 5로 설정합니다. 고정 변형은 시스틴의 카르바미도메틸이어야 하며, 가변 변형에는 아세틸 단백질 N-말단, 메티오닌의 산화, 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화가 포함되어야 합니다.
마지막으로 펩타이드 스펙트럼 일치, 펩타이드 및 단백질 그룹에 대한 거짓 발견률을 0.01로 설정합니다. LCMS와 MS proteomic 윤곽을 그리기에서는, 각 견본의 2%는 11 의 대략 2개, 200의 단백질에서 000의 유일한 펩티드 이상 계시했다. 특히, 72%의 고유 단백질이 세 가지 복제 모두에서 일관되게 발견되었으며 ExoCarta 데이터베이스와 비교하여 90개의 상위 EV 마커 및 단백질이 확인되었습니다.
정량적 정밀도는 5.7%의 저-중간 변동계수로 확인되었으며, 이는 높은 재현성과 신뢰성을 의미합니다. 인산단백질체학의 경우, 각 펩타이드 샘플의 98%에서 800개의 고유한 인산펩타이드와 350개의 인단백질이 생성되었습니다. 농축 결과 72%포스포세린, 22%포스트레오닌 및 6%포스포티로신 펩타이드가 생성되었습니다.
21.8%의 중간 변동 계수에서 모든 반복에서 42%의 인산펩타이드가 확인되었으며, 이는 허용 가능한 정량적 재현성을 나타냅니다.
