Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos

시작하려면 인큐베이터와 LED 마이크로플레이트 조명기를 사용하여 빛 노출 및 온도를 제어하기 위한 라이트 박스를 만듭니다. 그런 다음 인큐베이터의 상단 선반에 6웰 플레이트를 놓고 광선이 인큐베이터를 고르게 둘러싸는지 확인합니다. 종이 한 장을 사용하여 빛 범위의 분포를 시각화합니다.

조도 및 공간 균일성을 측정하기 위해 광도계를 사용합니다. 주사 하루 전, 주사 접시와 아가로스 코팅된 6개의 웰 플레이트를 만드십시오. 배아 배지로 주입 접시 몰드를 헹구고 털갈이와 아가로스 위에 부드럽게 놓습니다.

아가로스가 굳으면 탭을 섬세하게 사용하여 곰팡이를 제거합니다. 다음으로, 탈염소 배아에 대한 면역 형광 실험을 위해 화염 유리 피펫을 준비합니다. 유리 피펫의 끝을 롤빵과 버너 불꽃에 넣고 가장자리가 매끄러워질 때까지 계속 돌립니다.

여기에 표시된 mRNA를 사용하여 주입 혼합물을 준비합니다. 표현형 분석의 경우 바늘을 코리온을 통해 1세포 단계에서 세포 중앙에 직접 주입하고 1나노리터의 주입 혼합물을 주입합니다. 면역형광 분석을 수행하는 경우 단일 세포 단계에서 코팅된 배아의 세포 중심을 표적화합니다.

두 분석 모두 노출되지 않은 비주사, 노출되지 않은 주입, 노출된 비주입 및 노출된 주입된 배아에 대해 충분한 배아를 준비합니다. 조건당 최소 30개의 배아를 선택합니다. 면역형광 분석의 경우, 발달 단계의 진행을 평가하기 위한 대리물로 주입되지 않은 배아가 포함된 추가 접시를 준비합니다.

주입 후 섭씨 28도의 페트리 접시에 배아를 배양합니다.