시작하려면 층류 후드 내부의 수집 용기에서 갓 절제된 인간 오멘텀을 제거합니다. 오멘텀을 PBS에 담가 잔여 혈액이나 부스러기를 부드럽게 씻어냅니다. 메스와 집게를 사용하여 조직을 조각으로 자릅니다.
오멘텀 조각을 24웰 배양 플레이트의 개별 웰에 넣습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 오멘텀 배양 배지로 우물을 채웁니다. 75% confluent human mCherry 양성 난소암 세포가 들어 있는 배양 플라스크에 멸균 PBS 10mL를 추가합니다.
플라스크를 부드럽게 흔들어 세포를 씻습니다. PBS를 제거하고 0.05%trypsin EDTA의 3밀리리터를 추가합니다. 배양 플라스크를 다시 부드럽게 흔들어 부착된 세포에 트립신 EDTA를 고르게 분포시킵니다.
그런 다음 플라스크를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 농도로 5분 동안 둡니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플라스크를 꺼냅니다. 이제 배양 플라스크를 두드려 세포를 완전히 분리합니다.
그런 다음 트립신을 중화하기 위해 3ml의 오멘텀 배양 배지를 추가합니다. 셀 현탁액을 여러 번 피펫팅하여 잘 섞습니다. 서스펜션을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
1, 200 G에 현탁액을 24 섭씨 온도에 5 분 동안 분리하십시오. 이제 상층액을 피펫팅하고 세포 펠릿을 6ml의 신선한 오멘텀 배양 배지에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액 10마이크로리터를 취하여 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다.
세포 현탁액을 신선한 배양 배지로 필요한 밀도로 희석합니다. 1밀리리터 주사기로 암세포 현탁액을 끌어올립니다. 주사기에 26게이지 바늘을 부착합니다.
이제 한 쌍의 작은 수술용 집게를 사용하여 절단된 오멘텀 조각을 집어 들고 별도의 작동 중인 멸균 접시에 넣습니다. 그런 다음 약 100 마이크로리터의 암세포 현탁액을 조직에 주입합니다. 또는 동일한 부피의 해동된 기저막 매트릭스를 오멘텀 배양과 혼합합니다.
주입 될 때까지 혼합물을 얼음 위에 놓습니다. 오멘텀 조각을 배양 플레이트의 웰에 있는 매트릭스 혼합물에 담근 후 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
혼합물이 굳으면 오멘텀 조각에 암세포를 주입합니다. 형광 영상을 이용하여 암세포가 성공적으로 주입되었는지 확인합니다. 주사 부위에서 형광 신호의 줄무늬를 확인할 수 있습니다.
오멘텀과 암세포의 공동 배양을 촉진하기 위해, 48시간에서 72시간마다 500-200마이크로리터의 신선한 배지를 첨가하십시오. 마지막으로 형광 현미경을 사용하여 난소암 종양의 성장을 모니터링합니다. 종양 성장은 2주 후에 나타날 수 있습니다.
난소암 세포는 14일째에 오멘텀 조각에 성공적으로 통합되었습니다. 암세포는 처음 주에 오멘텀 표면 전체에 퍼졌습니다. 시간이 지남에 따라 세포가 모여 종양을 형성했습니다.
종양 부담은 붉은색에서 노란색으로 변하는 오멘텀 배지의 색 변화로 확인되었습니다.
