SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

먼저, 6웰 접시에 인간 배아 신장 293T 세포 1밀리리터를 뿌립니다. 2밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다. 다음 날, 배지를 항생제가 없는 신선한 배지로 교체하여 세포가 transfection을 준비할 수 있도록 합니다.

부착 세포를 transfection하려면 먼저 100 마이크로리터의 Opti-MEM에 플라스미드 DNA를 첨가하여 혼합 A를 준비합니다. 다음으로 17.5마이크로리터의 폴리에틸렌시민을 100마이크로리터의 Opti-MEM에 추가합니다. 혼합물 A와 B의 내용물을 섞은 다음 배양합니다.

배양하는 동안 3-4분마다 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합을 강화합니다. 혼합물의 전체 부피를 HEK 293T 셀이 있는 플레이트에 추가합니다. transfection의 16-20시간 후, 배양 배지를 새로운 완전 DMEM으로 교체합니다.

이산화탄소 5% 미만인 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하여 유사형 바이러스를 생성합니다. 형질주입 72시간 후, 상층액을 채취 튜브로 채취합니다. 상층액을 실온에서 7분 동안 1, 600G에서 원심분리합니다.

그런 다음 0.45마이크로미터 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 상층액을 여과합니다. 50웰 플레이트의 웰에 96마이크로리터의 완전한 DMEM을 분배합니다. 행 A를 비워 둡니다.

100 마이크로리터의 유사 바이러스 스톡을 A행의 웰에 추가합니다.그런 다음 A행에서 B행까지 용액 50마이크로리터를 피펫팅합니다.이 과정을 G행까지 반복하여 연속 희석을 얻습니다. 배양된 감수성 HEK 293T ACE2 세포가 있는 플레이트에서 배기된 배지를 제거하고 4ml의 DPBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 DPBS 식염수에 1밀리리터의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다.

이제 50 마이크로리터의 감수성 세포 현탁액을 유사형 바이러스가 들어 있는 각 웰에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 48시간 동안 배양합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 루시페라아제 시약을 추가합니다.

배양 후 각 웰의 내용물을 검은색 96웰 플레이트에 옮깁니다. 그런 다음 플레이트 리더에서 플레이트를 읽습니다. 96웰 플레이트에서 B열에서 H행까지 1열에서 10열에 50마이크로리터의 새 전체 DMEM을 추가합니다.95마이크로리터의 새 전체 DMEM을 열 A의 해당 웰에 추가합니다.이제 열 11의 웰에 50마이크로리터의 완전한 DMEM을 추가하고 열 12에 DMEM 100마이크로리터를 추가합니다.

5 마이크로리터의 열 비활성화 혈청 샘플을 A 열로 피펫팅합니다.다중 채널 피펫을 사용하여 첫 번째 행의 샘플을 혼합하고 50 마이크로리터의 배지 함유 혈청을 A행에서 B행으로 H 행까지 옮깁니다.배지를 함유한 희석된 슈도바이러스 50 마이크로리터를 열 1에서 11까지 각 웰에 분배합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 아래에서 1시간 동안 배양합니다. 감수성 HEK293T ACE2 세포의 현탁액을 5밀리리터로 준비합니다.

각 웰에 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한 다음 루시페라아제 분석을 수행하기 전에 배양합니다. 혈청 희석이 낮을수록 세포로의 바이러스 진입이 감소했습니다. 이것은 중화율의 증가로 확인됩니다.