Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

시작하려면 HEPES Buffered E3 배지 또는 E3로 1.8% 아가로스 플레이트를 준비합니다. 해부 현미경으로 작업하는 동안 6-10마리의 마취된 유충을 아가로스 플레이트에 일렬로 놓습니다. 각 유충의 머리에 곤충 핀을 하나씩 꽂습니다. 그런 다음 티슈를 사용하여 플레이트에서 나머지 E3를 제거합니다.

다른 곤충 핀을 사용하여 다른 장기를 건드리지 않고 유충으로부터 장을 분리하십시오. 노른자를 적절하게 제거하십시오. 격리가 완료되면 장을 검사하고 피부, 지방 또는 간과 같은 모든 비장 물질을 제거합니다.

핀셋을 사용하여 장을 채취하고 얼음 위에 놓인 미세 원심 분리 튜브에 10 % FCS가 포함 된 PBS로 옮깁니다. 모든 내장의 해부 직후, 13, 30 초 동안 800 g에 마이크로 원심 분리기 관을 분리하십시오. 상층액을 제거하고 장이 건조해지는 것을 방지하기 위해 튜브에 약 100마이크로리터를 남겨 둡니다.

500 마이크로리터의 파파인 용액을 튜브의 장에 추가합니다. 1몰 시스테인 2.5마이크로리터를 첨가하여 파파인을 활성화합니다. 그런 다음 장이 들어 있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 10분 동안 배양합니다.

효소 조직 소화를 자극하기 위해 5분 후 내용물을 위아래로 피펫팅합니다. 해리된 세포를 미리 결합된 35미크론 세포 스트레이너를 통해 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브로 옮깁니다. 총 세척량 0.5ml에 10%FCS가 포함된 PBS 2밀리리터를 추가하여 스트레이너를 여러 번 세척합니다.

채취한 여과액을 700g에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한다. 10% FCS를 포함하는 300마이크로리터의 PBS에 밀리리터당 1마이크로그램 DAPI를 추가합니다. 이 혼합물을 펠릿에 넣고 다시 현탁시켜 죽은 세포에 라벨을 붙입니다.

그런 다음 얼음 위에서 5분 동안 배양하여 후속 FACS 분석 중에 제외할 수 있도록 합니다.