단백질 분해 히스톤 펩타이드를 분석하기 위한 LC-TIMS ToF MS/MS 분석법을 개발하려면 C-18 컬럼이 장착된 HPLC를 독점적인 수동 기술이 적용된 상용 TIMS ToF MS 기기와 결합합니다. 다음으로, 나노 전기 분무 이온화 작동 조건을 4, 500V 모세관 전압, 800V 엔드 플레이트 오프셋, 3bar 분무기 압력, 분당 10리터 건조 가스 및 섭씨 200도 건조 히터로 설정합니다. MS 설정을 6개의 전자 볼트 충돌 에너지, 1200VPP 충돌 RF, 75마이크로초의 전송 시간 및 5마이크로초의 사전 펄스 저장으로 구성합니다.
주입량을 샘플의 8마이크로그램에 해당하는 20마이크로리터로 조정하고 유속을 분당 0.4밀리리터로 설정합니다. 지정된 그래디언트 타임라인과 0.1% 포름산 비율의 아세토나이드 시험을 입력한 후 두 팝업 상자에서 확인을 선택하여 분석법을 저장합니다. 0.1% 포름산이 포함된 물과 아세토니트릴을 사용하여 60분 비선형 LC 그래디언트를 실행합니다.
양이온화 모드에서 나노 전기 분무 이온화를 통해 HPLC에서 TIMS ToF로 시료가 용리되는지 확인합니다. MS-Digest 도구에서 펩타이드 염기서열 및 변형 부위를 식별하려면 Protein Prospector를 사용하여 이론적인 펩타이드 목록을 생성합니다. 그런 다음 분해 조건, 전사 후 변형 유형, 펩타이드 크기 범위, 질량 검출 범위 및 잠재적인 절단 누락 수를 고려하여 이론적 분해를 수행합니다.
수집된 데이터를 분석하려면 각 이론적 펩타이드에 대해 플러스 1에서 플러스 4에 이르는 여러 전하 상태에서 질량을 검색하십시오. 각 질량 대 전하 비율을 식별한 후 피크를 선택하고 펩타이드 서열을 기반으로 하는 단편화 이온의 이론적 목록을 사용하여 MSMS를 확인합니다. 번역 후 수정을 포함합니다.
펩타이드의 단편화 스펙트럼은 서로 다른 위치에서 프로피오닐 및 아세틸기를 포함한 다양한 전사 후 변형을 가진 세 가지 다른 펩타이드 변이체를 드러냈습니다. 프로피오닐화 히스톤 H3 표준물질은 변형되지 않은 버전보다 더 긴 펩타이드를 나타냈다. HeLa S3 세포에서 추출한 히스톤은 동일한 아미노산 위치에서 여러 번역 후 변형 패턴을 보여주었습니다.
