먼저, 환원 혈청 배지 3.75mL를 A로 표시된 튜브에 피펫팅하고 배지를 105마이크로리터의 형질주입 시약으로 희석합니다. 튜브의 내용물이 잘 섞이도록 소용돌이칩니다. 다음으로, 3.75 밀리리터의 환원 혈청 배지를 B.발현 플라스미드를 90 마이크로리터의 인핸서 시약으로 희석하는 라벨이 붙은 튜브에 첨가한다.
이제 튜브 A의 내용물을 튜브 B에 추가하고 용액을 피펫팅하여 배양 전에 잘 혼합합니다. 준비된 Phoenix 에코 플레이트에서 세포 배양 배지 10ml를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 transfection 혼합물의 전체 부피를 플레이트에 적하시킵니다.
인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. MTCM 바이러스 수확 배지를 섭씨 37도의 수조에 넣어 예열합니다. 이제 Phoenix 에코 플레이트를 기울이고 배양 배지를 피펫팅합니다.
다음으로, 예열된 바이러스 수확 배지 30mL를 기울어진 플레이트에 천천히 피펫팅합니다. 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 형질주입 48시간 후 바이러스 상층액을 수확합니다.
0.45마이크로미터 PVDF 필터를 통해 여과합니다. 멸균 주사기 뒷면을 사용하여 분리된 쥐 비장을 70-100마이크로미터 세포 여과기를 통해 50밀리리터 원뿔형 튜브로 분쇄합니다. 그런 다음 5mL의 T 세포 분리 완충액으로 여과기를 세척합니다.
세포의 최종 부피를 50밀리리터로 만든 후 혈구계로 세포를 계산합니다. 섭씨 4도 또는 실온에서 450G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 비장 세포가 포함된 세포 펠릿을 권장되는 T 세포 분리 키트로 재현탁시킵니다.
그런 다음 negative selection을 사용하여 CD3 양성 T 세포를 분리합니다. 자기적으로 분리된 분리물을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 셀 수를 다시 확인하십시오.
분리한 T 세포를 섭씨 4도에서 450G에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 MTCM 활성화 배지에 재현탁시킵니다. 이제 항체 코팅 마그네틱 비드와 인터루킨-2를 세포 현탁액에 추가하여 T 세포를 활성화합니다.
밤새 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 0일차에는 처리되지 않은 멸균 24웰 플레이트에 0.5밀리리터의 인간 피브로넥틴 형질 주입 인핸서 시약을 사전 코팅합니다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.
다음 날, 웰에서 형질 주입 시약을 꺼냅니다. 동일한 양의 멸균 여과된 BSA 보충 PBS를 실온에서 30분 동안 웰을 차단합니다. 배양 후 BSA PBS를 제거하고 0.5-1 밀리리터 PBS로 웰을 세척합니다.
다음으로, 미리 코팅된 각 웰에 1밀리리터의 깔끔한 레트로바이러스를 추가합니다. 2, 32 섭씨 온도에 90 분 동안 000 G에 격판덮개를 분리하십시오. 그런 다음 활성화된 T 세포 1밀리리터를 바이러스가 적재된 각 웰에 추가합니다.
섭씨 32도에서 450G에서 10분 동안 플레이트를 다시 원심분리합니다. 접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 5일째 되는 날, 항체 코팅된 비드에서 활성화된 T 세포를 해리시키기 위해 세포를 재현탁시킵니다.
셀 서스펜션을 자석에 30초 동안 놓습니다. 그런 다음 현탁액을 생체 외 배양 용기로 옮깁니다. 유세포 분석 전에 vessel을 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다.
T-세포 분리 키트를 사용한 결과, 형질도입 전 T-세포 순도가 98% 미만이었습니다. 65 내지 75%의 재현성 있는 CAR 발현율을 달성하였다. 인터류킨-7 및 15를 사용한 생체 외 배양은 단일 비장에서 활성화 후 10일까지 15배로 증가했습니다.
인터루킨을 사용한 T 세포의 배양은 유사한 CD8 양성 및 CD4 양성 T 세포 빈도로 이어졌습니다. 10일간의 체외 배양 후, 줄기세포 기억 집단이 보존되는 것이 관찰되었습니다.
