Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing

먼저 PBMC의 크라이오 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 부드럽게 뒤집으면서 2-3분 동안 해동합니다. 그런 다음 해동된 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1mL의 따뜻한 완전 성장 배지로 크라이오 바이알을 헹구고 용액을 원뿔형 튜브의 세포에 적가하여 첫 번째 희석 단계를 수행합니다.

이제 셀 현탁액을 5분 동안 원심분리하고 원뿔형 튜브를 유창하게 기울여 상층액을 제거합니다. 3 밀리리터의 따뜻한 완전 성장 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 계수를 위해 10마이크로리터의 세포 현탁액을 트리판 블루와 혼합합니다.

10 마이크로리터의 염색된 세포 용액을 사용하여 자동 세포 카운터 또는 세포 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 따뜻한 완전 성장 배지를 사용하여 세포를 희석하여 밀리리터당 10-6번째 세포의 최종 농도를 달성합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 파종합니다.

각 웰에 2회 약물 희석액 100마이크로리터를 추가합니다. 세포를 수확하려면 세포 배양 플레이트를 10분 동안 원심분리합니다. 진공 펌프를 사용하여 상층액을 제거하고 펌프 팁을 웰의 하단 모서리에 배치하여 세포를 유지합니다.

이제 각 우물에 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. 플레이트를 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 15마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다.

접착 밀봉 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하여 오염을 방지합니다. 플레이트를 소용돌이치게 하고 1분 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 용해된 세포 용액 6마이크로리터를 PCR 플레이트에 수집합니다.