CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing

시작하려면 원심분리를 통해 약물 처리된 PBMC를 수확하고 PCR 플레이트에서 세포 용해물을 수집합니다. 플레이트를 원심분리하여 바닥의 용해물을 수집합니다. 다음으로, thermocycler를 사용하여 mRNA 변성을 수행합니다.

그런 다음 각 웰에 6마이크로리터의 역전사 효소 반응 혼합물을 추가하여 총 부피 12마이크로리터를 얻습니다. 오염을 방지하고 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오. 플레이트를 잠깐 소용돌이친 후 원심분리합니다.

플레이트를 thermocycler에 놓고 역전사 반응 프로그램을 시작합니다. 역전사 후 PCR 플레이트를 원심분리하고 15마이크로리터의 사전 증폭 혼합물을 각 웰에 추가하고 밀봉합니다. 밀봉된 플레이트를 thermocycler에 놓고 사전 증폭 반응을 시작합니다.

cDNA를 세척하기 위해 각 웰에 자기 정제 비드를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 플레이트를 마그네틱 랙에 5분 동안 또는 비드가 분리될 때까지 놓습니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.

마그네틱 랙에 플레이트를 유지하면서 갓 준비한 100 % 에탄올 80 마이크로 리터를 부드럽게 도입하여 비드를 정화합니다. 30초 배양 후 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 마그네틱 랙에서 5분 동안 또는 에탄올이 완전히 증발하고 비드가 더 이상 반짝이지 않을 때까지 비드를 자연 건조시킵니다.

마그네틱 랙에서 플레이트를 제거한 후 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 비드를 다시 현탁합니다. 비드가 분리될 때까지 마그네틱 랙에 플레이트를 재배치합니다. 용출액을 cDNA 품질 관리 및 태깅을 위해 준비된 새로운 PCR 플레이트로 옮깁니다.

태그 지정의 경우, 각 반응에 대해 3 마이크로 리터의 태그 혼합물을 새 PCR 플레이트에 첨가합니다. 모든 반응에 1마이크로리터의 cDNA를 첨가하십시오. 태그 부착 반응을 즉시 시작하십시오.

그런 다음 각 반응에 1마이크로리터의 중화된 태그 완충액을 첨가하여 반응을 중화시킵니다. 농축 PCR의 경우 각 반응에 9마이크로리터의 농축 PCR 혼합물을 첨가하여 총 부피 14마이크로리터를 달성합니다. 농축 PCR 프로그램을 시작합니다.