먼저 25mm 유리 커버 슬립을 6웰 세포 배양 플레이트의 웰에 넣습니다. 각 커버 슬립의 중앙에 폴리리신 한 방울을 놓습니다. 배양이 완료되면 각 커버 슬립을 증류수로 세 번 씻습니다.
그런 다음 무칼슘 식염수로 커버 슬립을 두 번 씻습니다. 그런 다음 기록 챔버에 덮개를 설치하고 무칼슘 식염수로 채웁니다. 초파리의 원하는 유전자 교배에서 방황하는 세 번째 instar 유충을 수집하십시오.
유충을 접시 우물로 옮긴 다음 증류수로 유충을 세 번 씻습니다. 유충을 750마이크로리터의 얼음처럼 차갑고 칼슘이 없는 식염수가 들어 있는 다른 유리 해부 접시에 넣습니다. 이제 실체 현미경 아래에 유충을 놓습니다.
한 쌍의 집게로 복부 뒤쪽을 가로질러 가로로 자릅니다. 집게로 턱을 밀어 유충을 뒤집습니다. 턱 옆에 있는 복부 신경삭을 관찰합니다.
상상 디스크와 남아 있는 뇌 코들 조직을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 중앙 뇌와 시신경이 있는 복부 신경삭을 나머지 조직과 분리합니다. 복부 신경삭을 무칼슘 식염수가 들어 있는 기록실로 옮깁니다.
간섭을 피하려면 나머지 신경을 집게로 커버 슬립 바닥에 부착하십시오. 뚱뚱한 몸에 대한 실험을 수행하려면 밝혀진 유충에서 지방 조직을 분리하십시오. 초조한 센서를 발현하는 분리된 지방체를 기록 챔버에 배치합니다.
센서를 발현하는 조직의 이미지를 획득하려면 현미경의 조명 시스템을 켜십시오. 복부 신경삭 또는 지방체가 포함된 기록 챔버를 형광 현미경의 s에 놓습니다. GCaMP6f 형광을 보려면 여기 파장을 488나노미터로 설정합니다.
간결, 파이론, ATP 또는 포도당 센서와 같은 대사 산물의 경우 여기(excitation)를 440나노미터로 설정합니다. 이제 GCaMP6f 및 대사 산물 센서에 대한 이미지 획득을 일정한 간격으로 설정합니다. 침수 대물렌즈를 놓고 물속에 잠긴 상태를 유지합니다.
그런 다음 기록 챔버를 관류 시스템에 연결합니다. 저플럭스 연동 펌프를 사용하여 챔버에서 액체를 추출하고 분당 3밀리리터의 일정한 유량을 유지합니다. 튜브가 포함된 용액을 현미경 s에서 25cm 위에 배치합니다.tag이자형.
자극을 주기 전에 기록 용액을 5-10분 동안 흐르게 하여 안정적인 형광 기준선을 얻습니다. 이제 유동 용액을 포도당, 피루브산 또는 젖산이 포함된 자극 용액으로 5분 동안 교체합니다. 신경 활동을 평가하기 위해 80 마이크로몰 피크로톡신에 노출된 자극된 복부 신경삭의 이미지를 캡처합니다.
신경교세포(glial cell)와 운동 뉴런(motor neuron)의 간결한 센서는 맥박이 시작될 때 비슷한 속도로 1밀리몰 젖산에 반응합니다. 그러나 운동 뉴런은 5분 펄스 동안 기준선보다 더 높은 증가에 도달합니다. 포도당 센서의 신호는 5밀리몰 포도당에 노출되었을 때 신경교세포와 뉴런에서 비슷한 속도로 증가했다.
그러나 포도당 맥박이 뛰는 동안에는 신경교세포보다 뉴런의 신호가 더 많이 증가합니다. Chaski 수송체를 녹아웃하면 신경교세포의 젖산 수송이 감소했습니다. 피크로톡신에 의해 유도된 신경 활동의 증가는 운동 뉴런의 소마에서 ATP 수치의 일시적인 감소를 초래했습니다.
간결한 센서는 뚱뚱한 몸에서 잘 발현되는 것으로 관찰되었습니다. 포도당 센서의 증가된 형광은 지방체가 증가된 포도당 농도에 노출되었을 때 관찰되었습니다. 젖산염과 피루브산 농도가 증가하면 간결한 형광과 pyronic 형광이 비례적으로 증가했습니다.
