초저온 전자 현미경을 위한 Streptavidin 친화성 그리드 설계

시작하려면 벤치 부분을 70% 에탄올로 청소하십시오. 그런 다음 5마이크로리터 유리 주사기를 클로로포름으로 여러 번 헹굽니다. 탄소 증발 그리드는 사용 직전에 100% 에탄올로 세척하십시오.

깨끗한 여과지에 그리드를 말리십시오. 그 동안 각 모세관 방지 핀셋을 100% 클로로포름으로 세척한 다음 100% 에탄올로 세척합니다. 준비할 각 그리드에 대해 Parafilm의 깨끗한 면에 50마이크로리터 결정화 완충액 3방울을 준비합니다.

뚜껑을 결정화 완충액으로 채우고 코팅되지 않은 35mm 페트리 접시의 표면을 렌즈 종이로 닦습니다. 페트리 접시 둘레에 과학 등급의 활석 가루를 충분히 뿌립니다. 200 마이크로리터 피펫 팁을 피마자유에 담가 중간 크기의 방울을 떨어뜨립니다.

페트리 접시의 완충액 표면에 방울을 터치합니다. 부분 표본을 취하기 전에 용해된 지질로 5마이크로리터 유리 주사기를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 매달려 있는 0.5마이크로리터의 지질 방울을 피마자유 표면에 부드럽게 접촉하여 중앙에 지질 단층을 형성합니다.

여러 방울의 액체가 연속적으로 떨어지는 접시를 준비하십시오. 모세관 방지 핀셋으로 그리드를 집어 올려 핀셋의 직선 암과 그리드의 탄소 증발 면이 단층을 향하도록 합니다. 단층을 옮기려면 그리드의 탄소 증발 면을 단층에 1-2초 동안 터치합니다.

완충액의 구형 캡을 Parafilm에 놓인 3개의 50마이크로리터 결정화 완충액 방울에 순차적으로 접촉합니다. 4마이크로리터의 스트렙타비딘을 그리드에 있는 완충액의 나머지 구형 캡에 추가합니다. 그리드를 습도 챔버에서 2시간 동안 실온에서 배양합니다.

파라필름의 깨끗한 면에 300마이크로리터의 헹굼 버퍼를 준비합니다. 헹굼 버퍼 300마이크로리터 방울에 그리드를 올려 놓아 결합되지 않은 스트렙타비딘을 세척합니다. 그리드를 집으려면 마른 모세관 방지 핀셋의 꼬인 팔을 방울에 꽂습니다.

여과지로 격자를 닦아내고 금색이 아래로 향하도록 놓고 15-20분 동안 건조시킵니다. 건조되면 금색 면이 위를 향하도록 그리드를 뒤집습니다. 그리드를 탄소 증발기에 배치하여 그리드의 금 면에 얇은 탄소 층을 추가합니다.

Streptavidin 친화성 그리드로 냉동된 비오틴화된 샘플의 현미경 사진은 배경에서 연속적인 그리드 패턴을 보여주었습니다. 빠른 모피 변환의 회절 패턴은 성공적인 격자 형성을 더욱 확인했습니다. Cryo-EM 데이터 수집 후 Streptavidin 격자에 의해 제공된 신호를 계산적으로 마스킹하여 빼낸 현미경 사진을 생성할 수 있습니다.

빠른 모피 변환 결과는 스트렙타비딘에 대한 회절 패턴이 성공적으로 제거되었음을 보여주었습니다.