온전한 환자 유래 오가노이드 도금 및 Multiplexed Live-Cell Imaging을 위한 이미징 파라미터 설정

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January 5th, 2024

DOI :

10.3791/201045-v

January 5th, 2024

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Kaitriana E. Colling*¹^,², Emily L. Symons*¹, Lorenzo Buroni*³, Hiruni K. Sumanasiri¹, Jessica Andrew-Udoh¹, Emily Witt¹^,⁴, Haley A. Losh¹, Abigail M. Morrison¹, Kimberly K. Leslie⁵, Christopher J. Dunnill⁶, Johann S. de Bono³, Kristina W. Thiel¹^,⁷

¹Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, ²Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, ³The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, ⁴Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, ⁵Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, ⁶Agilent Technologies, ⁷Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다

필기록

시작하려면 환자 유래 오가노이드 또는 PDO 현탁액이 있는 튜브를 동일한 양의 기저막 추출물(BME)로 사용합니다. 20 마이크로리터 피펫을 사용하여 예열된 96 웰 플레이트의 각 웰 중앙에 5 마이크로리터 돔을 심습니다. 모든 우물을 파종한 후 접시에 뚜껑을 놓고 부드럽게 뒤집습니다.

거꾸로 된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 돔이 응고되도록 합니다. 뚜껑이 위쪽을 향하도록 접시를 뒤집습니다. 그런 다음 다시 부화하십시오.

형광 염료 및 약물을 PDO가 포함된 플레이트에 첨가한 후. 인용 5에 접시를 놓습니다. Gen5 소프트웨어를 시작하고 작업 관리자 창에서 이미저 수동 모드를 선택하고 지금 캡처를 클릭합니다.

설정에서 대물렌즈, 필터, 마이크로플레이트 형식 및 용기 유형을 지정하고 뚜껑 사용 및 느린 캐리어 속도 사용을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 관심 있는 우물을 선택하십시오. 명시야 채널을 선택하고 자동 노출을 클릭한 다음 필요에 따라 설정을 조정합니다.

Z 스택을 설정한 다음 이미징 모드 탭을 확장하고 Z 스택을 선택한 다음 모든 PDO의 초점이 맞지 않을 때까지 코스 조정 화살표를 사용하여 초점을 조정합니다. 이 점을 Z 스택의 맨 아래로 설정하고 역순으로 반복하여 맨 위를 설정합니다. 그런 다음 이미징 편집 단계를 열어 형광 채널을 설정합니다.

채널에서 원하는 채널 수를 선택하고 명시야에 하나의 채널을 지정하고 각 형광 채널에 대해 추가 채널을 지정합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫고, 드롭다운 메뉴를 GFP로 변경하여 첫 번째 형광 채널의 노출을 설정하고, 자동 노출을 클릭하고, 노출 탭에서 노출 설정을 조정하여 배경 신호를 줄입니다. 노출 설정을 이미지 모드 탭에 복사하려면 복사 아이콘을 클릭한 다음 이미징 단계 편집을 클릭하여 새 창을 엽니다.

GFP 채널에서 노출 라인의 클립보드 아이콘을 클릭하여 조명, 통합 시간 및 카메라 게인에 대한 설정을 채널에 추가합니다. 이제 카메라 아이콘을 클릭하고 처리 단계 추가에서 이미지 전처리를 선택합니다. brightfield(명시야) 탭에서 apply image pre-processing(이미지 전처리 적용) 옵션의 선택을 취소합니다.

각 형광 채널 탭에 대해 이미지 전처리 적용이 선택되어 있는지 확인합니다. 선택을 취소하고 채널 1과 동일한 옵션을 사용한 다음 확인을 클릭하여 창을 닫습니다. 이제 처리 추가 단계에서 Z 투영을 클릭하고 필요한 경우 슬라이스 범위를 조정한 다음 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.

키네틱 이미징을 위한 프로토콜을 설정하려면 도구 모음에서 이미지 세트를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 이 이미지 세트에서 실험 만들기를 선택합니다. 다른 제목 아래에 있는 옵션을 클릭하고 불연속 운동 절차 상자를 선택합니다. 예상 총 시간 아래에 실험의 런타임을 입력합니다.

확인을 클릭하여 창을 닫습니다. 또한 이때 플레이트 레이아웃과 온도 구배를 설정합니다. 창을 클릭하여 데이터 축소 단계의 유효성을 검사합니다.

그런 다음 파일로 이동하여 도구 모음에서 프로토콜 저장을 클릭합니다. 저장 위치를 선택합니다. 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다.

키네틱 이미징을 시작하려면 프로토콜을 바이오 스파 온디맨드 스케줄링 소프트웨어에 로드하고 사용 가능한 슬롯을 선택합니다. 절차 정보 탭의 메뉴에서 사용자를 선택합니다. 프로토콜 슬롯 옆에 있는 select(선택)를 클릭하고 add a new entry(새 항목 추가)를 선택합니다.

이제 프로토콜 슬롯 옆에 있는 선택을 클릭합니다. open(열기)을 클릭하여 프로토콜을 탐색하고 스케줄링 소프트웨어로 가져옵니다. 플레이트에 필요한 이미징 시간을 입력하고 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.

간격(Interval)에서 원하는 이미징 빈도를 입력하고 스케줄(schedule), 플레이트(plate) 또는 용기(vessel)를 선택하여 플레이트 검증 시퀀스를 시작한 다음 예(yes)를 클릭하여 이 일정을 적용합니다.

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