시작하기 위하여는, DMEM와 10%FBS를 가진 96의 좋은 판으로 10의 000의 간세포 암종 세포의 200 마이크로리터 양을 씨를 뿌립니다. 이산화탄소 5% 미만의 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음날 배양 배지를 교체하고 세포를 다양한 농도의 과산화수소와 메나디온으로 처리합니다.
5mg의 DHE를 DMSO 1밀리리터에 녹입니다. 작업 용액의 경우, 100마이크로몰 부분 표본을 예열된 DMEM 배지로 10마이크로몰 농도로 희석합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 5-10초 동안 작업 염료 용액을 소용돌이치십시오.
이제 암종 세포를 세우기 전에 각 웰에서 테스트 배지를 제거합니다. 그런 다음 PBS로 각각을 부드럽게 잘 씻으십시오. 각 웰에 100 마이크로 리터의 작업 염료 용액을 피펫팅합니다.
접시를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 각 웰에서 DHE가 포함된 매체를 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS로 각 웰을 세 번 세척합니다.
이제 Hoechst 33342 핵 염색 염료가 포함된 PBS 200마이크로리터를 각 웰에 피펫팅합니다. 배양 후 플레이트를 high-content screening 플랫폼으로 옮깁니다. Cellomics CX7 High-Content 스크리닝 소프트웨어를 실행합니다.
제조업체의 사양에 따라 이미징 플랫폼을 보정합니다. 기기 데이터베이스에서 플레이트 브랜드와 관련된 시스템 파라미터를 엽니다. 다음으로, 샘플이 있는 플레이트를 이미징 시스템의 가열된 스테이지에 조심스럽게 놓습니다.
플레이트가 단단히 배치되고 올바른 방향인지 확인하십시오. 그런 다음 마이크로플레이트를 부드럽게 눌러 s에 평평하게 놓이도록 합니다.tag이자형. 플레이트가 올바르게 배치되면 Control 키를 길게 누릅니다.
그런 다음 Control(제어) 및 OK(확인)를 클릭하여 Plate Load/Unload 대화 상자를 엽니다. 이미징 파라미터를 선택하려면 Cellomics BioApplications 인터페이스에서 Target Activation 모드를 엽니다. 핵 염색 및 DHE 형광 프로브와 호환되는 듀얼 채널 데이터 수집을 위한 새로운 프로토콜을 생성합니다.
그런 다음 이미지 획득에 필요한 대물렌즈를 지정한 다음 적절한 배율을 선택합니다. 이제 노출 시간, 카메라 벤딩 및 Z 스택 간격을 지정합니다. 이미징 파라미터가 설정되면 기기의 다양한 알고리즘을 사용하여 관심 있는 기본 추적 개체를 식별합니다.
식별된 개체를 분할한 후 각 세포 유형에 고유한 특정 크기, 모양 및 강도 매개변수를 기반으로 기본 개체를 검증합니다. 개체 주변의 관심 영역을 정의하고 그 주위에 20마이크로미터 원을 설정합니다. Population Characterization(모집단 특성화) 탭을 클릭한 다음 스캔 제한을 웰당 1000개 셀로 설정하고 필드당 최소 10개의 개체를 설정합니다.
이제 Launch View(보기 시작)를 클릭하여 각 웰 플레이트를 스캔합니다. 그런 다음 뷰 분석 소프트웨어를 실행하고 추가 분석을 위해 정량적 데이터 매개변수를 CSV 형식으로 내보냅니다. 과산화물 노출은 용량 의존적 방식으로 모든 세포주에 걸쳐 ROS 유도 형광의 통계적으로 유의한 증가를 초래했습니다.
menadione로, JHH-4 세포는 형광성 강렬에 있는 복용량 의존하는 증가를 보여주었습니다. 그러나 형광의 현저한 차이는 다른 두 세포주에서 더 높은 농도에서만 관찰되었습니다.
