시작하려면 특정 프라이머 515f 및 806r을 사용하여 16S rNA 유전자의 V4 초가변 영역을 증폭합니다. 주어진 조건을 사용하여 PCR을 수행합니다. 다음으로, 3.5 마이크로리터의 염기서열분석 완충액과 1.5 마이크로리터의 효소 혼합물을 튜브에 추가합니다.
샘플을 혼합하고 회전시킨 후 열순환기 반응을 설정합니다. 이제 어댑터 결찰 혼합물을 튜브에 넣고 섭씨 20도에서 열순환기에서 15분 동안 배양합니다. 1.5 마이크로리터의 우라실 특이적 확장 시약 효소를 연결 혼합물에 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
이제 43.5 마이크로리터의 마그네틱 비드를 어댑터 결찰 DNA에 추가하고 20회 혼합합니다. 5분 후, 비드 분리를 위해 튜브를 마그네틱 랙에 5-10분 동안 놓고 상층액을 버립니다. 펠릿을 100 % 에탄올의 80 마이크로 리터로 씻고 비드를 30 초 동안 건조시킵니다.
펠릿에서 비드를 용리하려면 8.5 마이크로 리터의 10 밀리 몰 Tris HCl을 튜브에 넣고 2 분 동안 배양하십시오. 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 7.5 마이크로리터의 상층액으로 제거된 DNA를 새 튜브에 넣습니다. PCR 시약을 접합된 DNA 함유 튜브에 첨가하여 25 마이크로리터 반응을 설정합니다.
증폭된 DNA를 세척하려면 22.5마이크로리터의 마그네틱 비드를 튜브에 넣고 20회 혼합합니다. 5분 후 상층액 50마이크로리터를 제거하고 80% 에탄올 100마이크로리터로 비드를 세척합니다. 짙은 갈색 구슬을 16마이크로리터의 물에 다시 현탁시키고 20회 혼합합니다.
튜브를 마그네틱 랙에 30-60초 동안 놓고 15마이크로리터를 새 튜브로 옮깁니다. 완충액 90마이크로리터, 염료 1마이크로리터, DNA 라이브러리 샘플 2마이크로리터를 혼합하고 형광측정기에서 DNA 농도를 판독합니다. DNA를 2나노몰로 희석한 후, 27 내지 30 마이크로리터의 플로우 셀을 로딩하여 시퀀서에 넣습니다.
시퀀서에서 얻은 FASTQ 파일을 저장합니다. 스프레드시트 파일을 열고 매핑 또는 메타데이터 파일을 작성하려면 클릭합니다. Nephele 열기 web사이트를 열고 FASTQ 파일을 업로드하고 QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming을 읽습니다.
다음으로, DADA2를 사용하여 역다중화 쌍단부 읽기, 필터 대체, 키메라 오류 및 병합을 실행합니다. Silva 버전 132 99% 작동 분류 단위 또는 OTU 데이터베이스에서 학습된 Naive Bayes 분류기를 사용하여 97% 유사성으로 박테리아 분류 할당을 수행합니다. MicrobiomeDB 웹 사이트를 엽니다.
클릭하여 파일을 업로드하고 OTU 알파 다양성, 베타 다양성, 상대 풍부도 및 희귀 곡선을 생성합니다. 마지막으로 스프레드시트를 열고 데이터를 전송하여 히트 맵, 벤 다이어그램 및 선형 판별 분석 효과 크기를 만듭니다. 포도주 양조의 여러 단계에서 박테리아의 상대적 풍부도를 기반으로 한 히트 맵은 Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota 및 Fusobacteriota와 같은 문(phyla)의 우세를 표시했습니다.
속 수준에서는 Enterobacteriaceae 및 Lactobacillaceae와 같은 중요한 속이 확인되었습니다. 벤 다이어그램 분석은 포도 머스트에서 최종 와인에 이르기까지 15개의 고유한 OTU를 공유하는 것으로 나타났습니다. V4 가변 영역을 기반으로 한 앰플리콘 염기서열 분석 결과, 두 개의 트라미넷 R 및 L.베타 다양성 분석에서 알파 다양성은 발효 중 박테리아의 이동을 보여주었지만 최종 와인의 박테리아 조성은 머스트 및 효모 첨가 단계와 유사했습니다.
