애팔래치아 주립대학교 연구위원회(URC) 보조금과 브라질 상파울루 리베이랑 프레투에 있는 상파울루 대학교(Universidade de São Paulo)의 FAO 방문을 지원한 CAPES Print Travel 펠로우십의 자금 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001에 의해 부분적으로 재정 지원을 받았습니다. ECPDM은 그녀의 애팔래치아 주립대학교 방문을 지원해 준 CAPES Print Travel 보조금에 감사하고 있습니다. ECPDM은 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq)의 연구원입니다.

1. 실험적인 와인 생산
<ol><li>노스캐롤라이나주 존스빌 포도밭에 있는 다이나미스 에스테이트 와인에서 트라미네트 포도를 구해 줄기를 제거하고 으깬 후 두 개의 별도 600L 오픈탑 발효기에 넣어 뚜껑을 덮은 상태로 약 4일 동안 껍질에 그대로 둡니다.</li>
	<li>하루에 한 번 뚜껑을 아래로 내려 피부를 촉촉하게 유지하고 휘발성 산(VA) 생성을 제한하십시오. 참고: 아이디어는 많은 방향족 전구체(모노테르펜)가 껍질에 위치하고 주스를 피부와 접촉시켜 와인의 방향족 잠재력을 증가시킨다는 것입니다.</li>
	<li>4일 후, 맥주효 모 균 추출물 추출물 QA23 (Lallemand)을 투여합니다. 이 효모는 강력한 발효기이며 포도에서 와인의 품종 특성을 향상시키는 것과 관련이 있기 때문에 선택되었습니다.</li>
	<li>한 탱크인 Traminette R에 Brix가 17.7일 때 20g/hL Fermaid O를 추가하고 13.1g/hL일 때 20g/hL Fermaid O와 12.5g/hL Fermaid K를 추가하여 발효 안전성을 확보하고, 다른 탱크인 Traminette L에 Brix가 17.1일 때 40g/hL Stimula Sauvignon blanc을 추가합니다. 또한 브릭스가 13.4일 때 20g/hL Fermaid O를 추가하여 와인의 품종 특성을 향상시킵니다.</li>
	<li>머스트(1일차), 효모 첨가(4일차), 발효 머스트(15일차) 및 완제품 와인 샘플(30일)의 중복 샘플을 채취하고 DNA 추출 및 균유전체 분석 전에 -20°C에서 보관합니다.</li>
</ol>2. 균유전체학을 위한 DNA 추출
<ol><li>첫 번째 원심분리까지 위에서 얻은 모든 중복 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>발효된 샘플 20mL를 멸균 50mL 스크류 캡 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>찬물 10mL를 넣고 균질화(와류)합니다. 4°C에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 새 50mL 튜브로 옮깁니다. 알림: 이 단계는 샘플의 고형물을 제거합니다.</li>
	<li>2.3단계를 두 번 반복하고 상층액을 동일한 튜브에 합칩니다.</li>
	<li>4°C에서 3,000 x g 에서 20분 동안 상층액을 원심분리하여 세포를 펠트합니다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>펠릿을 1mL의 PBS에 재현탁시키고 2mL 스크류 캡 튜브로 옮기고 14,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. PBS를 사용하여 두 번 더 세탁하십시오.</li>
	<li>이 단계에서 펠릿을 -20°C에서 얼리거나 2.8단계를 따르십시오. 모든 샘플을 동일한 방식으로 처리하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>978μL의 인산나트륨 완충액을 추가합니다. 인산나트륨 완충액을 제조하고NaH2PO4· H2O와Na2HPO4(무수) 10.9g을 증류하여 1 L의 부피를 만들고, pH를 7.4로 조절한다.</li>
	<li>122μL의 DNA 완충액(DNA 스핀 키트)과 와류를 추가합니다.</li>
	<li>냉장고(4°C)에서 45분-1시간 동안 그대로 둡니다. 15분마다 샘플을 소용돌이칩니다. 이 단계는 하룻밤(o/n) 또는 DNA 스핀 키트를 계속 사용할 준비가 될 때까지 그대로 둘 수 있습니다.</li>
	<li>1mL의 샘플을 용해 용액 1 튜브(DNA 스핀 키트)에 옮기고 캡을 조입니다(캡이 아닌 튜브 측면에 샘플 번호를 적으십시오. 키트 시약은 캡에 적힌 모든 것을 제거합니다).</li>
	<li>비드 비팅 그라인더(6.5m/s, CY: 24 x 2)에서 60초 동안 샘플을 3회 균질화합니다. 비드 비팅 그라인더에 얼음을 넣는 장치가 있는 경우 튜브 아래에 드라이아이스 50g을 넣습니다. 그렇지 않은 경우 샘플을 각 균질화 단계 사이에 5분 동안 젖은 얼음 위에 보관합니다.</li>
	<li>원심분리기 용해 매트릭스 E 튜브(DNA 스핀 키트)를 16800 x g(또는 최대 속도)에서 1분 동안 가열합니다.</li>
	<li>상층액을 깨끗한 마이크로튜브로 옮깁니다. 그 후 단백질 침전 용액(PPS) 시약(DNA spin kit) 250μL를 넣고 튜브를 손으로 10회 흔들어 혼합합니다.</li>
	<li>침전물을 펠릿화하기 위해 16800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 멸균된 15mL 튜브에 옮깁니다. 1mL의 결합 매트릭스 현탁액(DNA 스핀 키트)을 상층액에 추가합니다. 알림: 바인딩 매트릭스 서스펜션이 균질해질 때까지 사용하기 전에 다시 현탁하십시오.</li>
	<li>튜브를 손으로 뒤집어 2분 동안 뒤집은 다음 튜브를 랙에 3분 동안 그대로 둡니다(실리카 매트릭스가 침전될 수 있도록).</li>
	<li>상층액 1mL를 조심스럽게 제거합니다. 나머지 상층액에 매트릭스를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>혼합물 600μL를 스핀 필터 튜브(DNA 스핀 키트)에 옮기고 14500 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>남은 혼합물과 원심분리기를 추가합니다.</li>
	<li>플로우스루를 디캔트하고 500μL의 세척 용액(DNA 스핀 키트)을 스핀 필터 튜브에 추가하고 14500 x g에서 1분 동안 원심분리합니다(세척 용액에 EtOH를 추가해야 합니다. 제품 핸드북 참조). 플로우 스루를 디캔팅하고 두 번 더 세탁을 반복합니다(총 3회 세탁).</li>
	<li>플로우 스루와 원심분리기를 14,500 x g 에서 추가로 2분 동안 디캔팅하여 잔류 세척 용액 매트릭스를 건조시킵니다.</li>
	<li>탈수 필터를 제거하고 새 캐치 튜브(DNA 스핀 키트)에 넣습니다. 스핀 필터를 실온(RT)에서 5분 동안 자연 건조합니다.</li>
	<li>DNAse가 없는 물(DNA 스핀 키트)을 55°C에서 5분 동안 데웁니다. DNAse가 없는 물 50μL를 넣고 DNA를 효율적으로 용출하기 위해 피펫 팁으로 필터 멤브레인의 매트릭스를 부드럽게 저어줍니다. 샘플을 실온에서 1분 동안 그대로 둔 다음 14500 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리합니다.</li>
	<li>샘플을 얼음 위에 놓습니다. 시료 혼합물(시료 2μL + 물 2μL + 로딩 버퍼 1μL)을 겔에 넣습니다. DNA 농도를 측정합니다.</li>
	<li>샘플을 -20 °C에서 보관합니다.</li>
	<li>분광 광도계를 사용하여 추출된 DNA를 정량화합니다. 참고: 1μL 부피의 DNA를 적하하고 정량화했으며 DNA의 품질은 A260/A280 비율로 기록되었습니다.</li>
</ol>3. DNA 전기영동
<ol><li>1 Tris/Borate/EDTA(TBE) 완충액(미니 겔의 경우 20mL, 중간 겔의 경우 70-100mL)에 0.5% 아가로스 겔을 준비합니다. 아가로스+완충액의 무게를 달고 전자레인지에 끓여 아가로스를 녹인 후 다시 무게를 잰 다음 원래 무게에 dH2O를 추가합니다. 아가로스 용액을 55-60 °C로 식히고 빗 어셈블리가 있는 겔 포머에 붓습니다. 젤이 굳도록 두십시오.</li>
	<li>샘플(10μL)에 1μL의 10x 겔 로딩 버퍼를 추가하고 분자량 마커 옆에 있는 겔에 로딩합니다. 파란색 염료가 바닥 근처에 올 때까지 100-115V(대형 젤) 또는 90V(미니 젤)에서 음극(검은색)에서 양극(빨간색)으로 실행합니다.</li>
	<li>1 μL/mL 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 그린(니트릴 장갑 및 고글 필요)에 30분 동안 겔을 염색하고 물로 헹구고 자외선(UV) 광원 아래에서 봅니다. 중복된 샘플에서 추가 처리를 위해 가장 높은 수율을 선택합니다.</li>
</ol>4. 고처리량 시퀀싱
<ol><li>특정 프라이머 515F(5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') 및 806R(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22을 사용하여 16S rRNA 유전자의 V4 초가변 영역을 증폭합니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 조건을 94°C에서 2분, 94°C에서 20초, 58°C에서 20초, 65°C에서 1분, 65°C에서 10분(최종 연장)으로 설정합니다.</li>
	<li>고충실도 PCR 마스터 믹스(재료 표)를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다.</li>
	<li>DNA 라이브러리 준비 키트로 라이브러리를 생성한 후 염기서열분석 플랫폼에서 paired-end sequencing을 사용하여 염기서열분석을 수행할 수 있습니다. 참고: 여기에서 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit로 생성된 라이브러리는 novaseq6000 플랫폼에서 paired-end Illumina 염기서열분석(2 × 250bp)을 사용하여 시퀀싱되었습니다.</li>
	<li>시퀀싱 단계를 따릅니다.<ol><li>1단계: 일반적으로 일반적인 크기를 선택하는 방법으로 효소로 DNA를 전단합니다.<ol><li>3.5μL의 염기서열분석 완충액과 1.5μL의 효소 혼합물을 25μL의 DNA(약 1μg)에 넣고 피펫으로 10회 혼합하고 빠르게 회전시킵니다.</li>
			<li>뚜껑을 75°C로 예열하고, (1) 30°C에서 20분 (2) 30°C에서 65분 (3) 4°C로 예열합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>2단계: 결찰을 통해 어댑터 추가<ol><li>피펫을 사용하여 15μL의 ligation master mix, 1.25μL의 adapter, 0.5μL의 ligation enhancer 및 30μL의 end prep DNA mix를 추가합니다.</li>
			<li>20°C에서 thermocycler에서 15분 동안 배양한 다음 1.5μL의 우라실 특이적 절제 시약(USER) 효소를 연결 혼합물에 추가하여 총 48.26μL를 얻습니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
			<li>어댑터 결찰 DNA에 43.5μL의 마그네틱 비드를 추가하고 피펫으로 20회 혼합한 후 RT에서 5분 동안 배양합니다. 마그네틱 랙으로 비드를 분리한 다음 5-10분 동안 배양하고 상층액을 버립니다.</li>
			<li>펠릿을 100 % 에탄올 80 μL로 세척하고 30 초 동안 건조시킨 다음 다시 세척하십시오. 8.5 μL의 10 mM Tris HCl / 0.1x Tris-EDTA (TE) / HPLCH 20에 비드와 펠릿을 용출하고 피펫과 혼합하고 RT에서 2 분 동안 배양합니다.</li>
			<li>마그네틱 랙에서 배양하고 7.5μL의 용출된 DNA를 상층액으로 제거합니다. 용리액을 새 튜브에 넣고 PCR 단계를 수행합니다.</li>
			<li>먼저, 12.5 μL의 마스터 믹스, 2.5 μL의 index primer i7 primer, 2.5 μL의 universal PCR primer/i5 primer를 7.5 μL 어댑터 접합 DNA에 첨가하여 25 μL의 PCR 반응 믹스를 얻습니다. 다음 PCR 조건을 사용하십시오: 뚜껑을 103°C로 예열합니다. 98°C에서 30초, 98°C에서 10초, 65°C에서 75초, 65°C에서 5분, 4주기 후 10°C에서 유지합니다.</li>
			<li>25μL 증폭된 DNA를 세척합니다. 22.5μL의 마그네틱 비드를 넣고 20회 혼합합니다. 상온에서 5분 동안 배양하고 상층액 50μL를 제거합니다. 80% 에탄올 100μL로 비드를 세척하고 비드를 30초 동안 부드럽게 건조시켜 모든 에탄올을 제거합니다.</li>
			<li>짙은 갈색 비드를 16μL의 물에 다시 현탁시키고 피펫으로 20회 혼합한 다음 마그네틱 랙에 30-60초 동안 놓습니다. 15μL를 새 튜브로 옮깁니다.</li>
			<li>형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 완충액 90μL + 염료 1μL + DNA 라이브러리 샘플 2μL를 혼합하고 농도를 판독합니다. DNA를 2nM로 희석하고 플로우 셀에 27-30μL를 로드한 다음 시퀀서에 넣습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>3단계: 어댑터의 염기서열을 분석하고, 위에서 생성된 라이브러리를 패턴화된 플로우 셀의 매트릭스에 하이브리드화하고, 제조업체의 지침에 따라 DNA를 캡처합니다. 두 번째 합성을 위한 템플릿으로 사용합니다.<ol><li>그런 다음 두 번째 가닥을 클론 클러스터로 증폭합니다. 클러스터를 선형화하고 활성 사이트를 차단합니다. 시퀀싱 프라이머를 추가하여 manuacturer의 프로토콜에 따라 시퀀스에서 합성에 의한 시퀀싱을 위한 사이트를 제공합니다. 참고: 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 자연 상보성을 사용하여 DNA 템플릿 가닥에 결합합니다. 각 뉴클레오티드에는 형광 태그와 다음 염기의 포함을 차단하는 가역 종결제가 있습니다. 그러므로, 형광 신호의 존재는 어떤 뉴클레오티드가 삽입되었는지를 나타내고, 종결인자는 결합할 다음 염기를 위해 절단된다.</li>
		</ol></li>
		<li>4단계: 단일 결합 가닥을 증폭하여 합성에 의해 나란히 서열화된 염기서열 클러스터를 제공합니다. 참고: 클러스터는 양방향 스캐닝 및 2채널 시퀀싱 화학을 통해 단일 가닥보다 더 밝은 신호를 제공합니다. 시퀀싱 소프트웨어는 데이터 분석을 위해 기본 호출(*.cbcl) 파일을 지정된 출력 폴더 위치로 자동 전송합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 생물정보학
<ol><li>시퀀스 데이터를 FASTQ 파일로 생성합니다. 다음 부분을 포함하도록 분석합니다.<ol><li>파트 I :<ol><li>시퀀서에서 가져온 FASTQ 파일을 저장하고 클릭하여 스프레드시트 파일을 열고 매핑/메타데이터 파일을 생성합니다.</li>
			<li>Nephele 열기 web사이트(https://nephele.niaid.nih.gov/), FASTQ 업로드 files, QIIME222에서 QC, 필터링 및 트리밍을 읽습니다. 원시 염기서열을 SRA(Sequence Read Archive) 및 GenBank로 NCBI BioProject(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)에 보관합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>파트 II: Nephele 웹 사이트(https://nephele.niaid.nih.gov/)로 이동하여 역다중화 쌍 끝 읽기, 필터 대체 및 키메라 오류를 수행하고 DADA223을 사용하여 병합합니다. Silva 버전 132 99% OTU 데이터베이스에서 훈련된 Naive Bayes 분류기를 사용하여 97% 유사성24에서 박테리아 분류 할당을 수행합니다.</li>
		<li>파트 III: MicrobiomeDB 웹사이트를 열고 클릭하여 파일을 업로드하고 OTU 알파 다양성, 베타 다양성, 상대 풍부도 및 희귀 곡선(https://microbiomedb.org/mbio/app)을 생성합니다.</li>
		<li>파트 IV: 스프레드시트를 열고 데이터를 전송하여 히트맵, 벤 다이어그램 및 선형 판별 분석 효과 크기(https://microbiomedb.org/mbio/app)를 만듭니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>QIIME222를 열고 alpha-group-significance 스크립트를 사용하여 그룹 간 알파 다양성의 유의한 차이를 확인합니다. 이것은 또한 Kruskal-Wallis 테스트를 수행합니다.</li>
	<li>쌍별 검정을 포함하여 PERMANOVA를 사용하여 그룹 간 베타 다양성의 차이를 결정합니다25.</li>
	<li>MicrobiomeDB를 사용하여 그룹 간의 박테리아 군집 구조에서 중요한 차이점을 얻습니다. p-값 ≤0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.</li>
</ol>

Amplicon metagenomics를 사용한 포도의 박테리아 군집 프로파일링

<ol>
	<li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette,+gew&#252;rztraminer,+and+riesling+winegrapes.">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gew&#252;rztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li><li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette.">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li><li>Reisch, B. 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J., Rodr&#305;&#769;guez-Vico, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+oenological+properties+of+wine+yeasts+isolated+during+spontaneous+fermentation+of+six+varieties+of+grape+must.">Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must.</a> Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).</li><li>Attila, K. &. #. 1. 9. 5. ;., Kluz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+microflora+of+wine+grape+berries.">Natural microflora of wine grape berries.</a> Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).</li><li>Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+viable+grapevine+microbiome+to+enhance+the+quality+of+wild+wines.">Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines.</a> Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).</li><li>Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+different+fermentation+behaviours+of+two+indigenous+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+uvarum+isolated+from+Amarone+wine.">Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).</li><li>Stefanini, I., Cavalier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+approaches+to+investigate+the+contribution+of+the+vineyard+environment+to+the+quality+of+wine+fermentation:+potentials+and+difficulties.">Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).</li><li>Caporaso, J. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+methods+for+the+study+of+plant-associated+microbial+communities:+A+review.">Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review.</a> Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).</li><li>van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+state-of-art+sequencing+technologies+to+indigenous+food+fermentations.">Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).</li><li>V&#237;quez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+the+green+wall:+The+use+of+PNA-DNA+clamps+to+enhance+microbiome+sampling+depth+in+wildlife+microbiome+research.">Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research.</a> Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).</li><li>Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu, I. V., Morozov, S. V., Bukin, A. S., Zakharenko, T. I., Zemskaya, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6, 190007 (2019).</li></ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

균유전체학(metagenomics)의 프로토콜은 포도 머스트(must)의 샘플링에서 시작되며, 머스트에 효모가 첨가되면 발효 와인과 최종 와인 샘플이 됩니다. 그 다음에는 이들 샘플에서 성공적으로 추출된 중복 DNA 추출이 뒤따랐습니다. 얻어진 양은 농도가 15ng/μL에서 87ng/μL까지 다양했습니다. 이는 DNA 추출 프로토콜이 와인의 메타게놈 연구에 효과적임을 보여줍니다. A260/A280에서 DNA의 품질은 다양하지만, ?...

트라미네트 포도는 우수한 품질의 와인 생산이 특징이며, 상당한 수확량과 여러 곰팡이 감염에 대한 부분적인 저항성이 있습니다 1,2,3. 포도의 자연 발효는 관련 미생물, 와인 생산 환경 및 발효 용기에 의존합니다 4,5. 종종 많은 와이너리에서는 발효, 알코올 생산, 에스테르, 향 및 풍미 개발을 위해 야생 효모와 박테리아에 의존합니다6.
이 연구의 목표는 포도의 박테리아 구성을 조사하고 발효 중 역학을 모니터링하는 것입니다. 알코올이 생산되는 1차 발효를 위해 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)과 같은 스타터 배양균을 현대적으로 사용하는 것은 다양한 와인 스타일에 공통적이다7. 또한 말산이 Oenococcus oeni에 의해 젖산으로 탈카르복실화되는 2차 발효는 와인의 관능 및 맛 프로필을 개선하고 와인의 산도를 감소시킵니다 8,9. 최근 배양 독립적 방법의 사용이 발전함에 따라, 이제 와인 포도와 관련된 다양한 미생물 및 머스트(must)로 옮겨진 종을 결정하고 최종 생성물(10)까지 상이한 시간에 발효에 참여할 수 있다.
와인 발효 과정에서 머스트(must)로 옮겨진 다양한 포도의 야생 박테리아의 역할과 역학은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 박테리아 중 많은 수의 분류학은 알려져 있지 않거나 표현형 특성이 특성화되지 않았습니다. 이로 인해 공동 배양 발효에 대한 적용은 여전히 제대로 활용되지 않습니다. 그러나 미생물 배양 기반 분석은 포도 및 와인과 관련된 박테리아 개체군을 결정하는 데 사용되었습니다10. 선택적 배양 도금은 지루하고 오염되기 쉬우며 재현성이 낮고 출력이 의심스러울 수 있다는 것은 널리 알려져 있습니다. 또한 성장 요구 사항을 알 수 없는 박테리아 종도 놓치고 있습니다. 이전 연구에 따르면 배양에 독립적인 16S rRNA 유전자 기반 방법론은 복잡한 미생물 군집을 특성화하는 데 보다 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다11. 예를 들어, 16S rRNA 유전자의 초가변 영역 염기서열 분석은 포도 잎, 열매 및 와인 12,13,14의 박테리아를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 연구에 따르면 16S rRNA 메타바코딩 또는 전체 메타게놈 염기서열분석(whole metagenomic sequencing)을 사용하는 것이 마이크로바이옴 연구에 적합하다15. 와인 생산 중 박테리아 다양성과 신진대사 특성의 연관성에 대한 새로운 정보가 있으며, 이는 와인 양조학적 특성과 떼루아를 결정하는 데 도움이 될 수 있다16.
포도 및 와인 미생물 생태학을 연구하기 위해 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하는 메타게놈 도구의 이점을 극대화해야 할 필요성이 강조되었습니다16,17. 또한 식품 및 발효 생태계의 미생물 다양성을 프로파일링하기 위해 고처리량 염기서열 분석을 기반으로 하는 배양 독립적 분석법의 사용은 많은 실험실에서 매우 관련성이 높고 가치가 있으며 산업용으로 권장됩니다18,19. 이는 현재 미생물 개체군의 검출 및 분류학적 프로파일링과 환경 미생물의 기여도, 상대적 풍부도, 알파 및 베타 다양성의 이점을 제공한다20. 16S 영역의 가변 영역의 염기서열 분석은 선택의 중요한 유전자가 되었으며 다양한 미생물 생태학적 연구 중에 사용되었습니다.
많은 연구가 와인 발효 중 곰팡이, 특히 효모에 초점을 맞추고 있지만(21), 이 연구는 와인 생산을 위한 트라미네트 포도 발효 중 박테리아를 연구하는 데 사용된 16S 앰플리콘 시퀀싱 및 생물정보학 도구를 보고했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI USA</td>
			<td>V3121</td>
			<td>Electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep DNA spinKit for soil&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals, Solon, OH USA</td>
			<td>116560-200</td>
			<td>DNA extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC software</td>
			<td>Babraham Institute, United Kingdom</td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatics&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermaid O</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Fidelity PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>F630S</td>
			<td>Polymerase chain reaction for sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>NEB #E7103</td>
			<td>DNA Library Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq Control Software (NVCS)</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq6000 platform&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuiBit</td>
			<td>Thermoscientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickdrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Molecular device, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td>DNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimula Sauvignon Blanc</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling the bacterial community of fermenting traminette grapes during wine production using metagenomic amplicon sequencing

염기서열 분석 기술의 발전과 미생물 군집 구조를 프로파일링하기 위한 생물정보학 도구 사용에 대한 비교적 쉬운 접근은 포도와 와인의 배양 가능한 미생물과 배양 불가능한 미생물 모두에 대한 더 나은 이해를 촉진했습니다. 산업 발효 과정에서 알려지거나 알려지지 않은 미생물은 종종 제품 개발 및 맛 제거를 담당합니다. 따라서 포도에서 와인에 이르기까지 박테리아를 프로파일링하면 현장 미생물 역학을 쉽게 이해할 수 있습니다. 이 연구에서 트라미네트 포도의 박테리아는 발효를 거쳐야 하며, 최종 와인은 15ng/μL에서 87ng/μL를 산출하는 DNA 추출을 거쳤습니다. V4 영역의 초가변 영역의 16S 앰플리콘을 서열분석하였고, 프로테오박테리아(Proteobacteria), 악티노박테리오타(Actinobacteriota), 피르미쿠테스(Firmicutes), 박테로이도타(Bacteroidota), 푸소박테리오타(Fusobacteriota)로 구성된 비교적 풍부한 박테리아를 서열화하였고, 그 뒤를 이어 베루코마이크로바이오타(Verrucomicrobiota), 할로박테로타(Halobacterota), 데설포박테로타(Desulfobacterota), 믹소코코코타(Myxococcota) 및 애시도박테리오타(Acidobacteriota)가 뒤따랐다. 공유된 고유한 OTU(Operational Taxonomic Unit)에 대한 벤 다이어그램 분석에 따르면 15개의 박테리아 문(phyla)이 포도 머스트, 발효 단계 및 최종 와인 모두에 공통적으로 나타나는 것으로 나타났습니다. 이전에 보고되지 않았던 문(phyla)은 16S 앰플리콘 시퀀싱(amplicon sequencing)뿐만 아니라 장내세균(Enterobacteriaceae) 및 락토바실러스과(Lactobacillaceae)와 같은 속(genera)을 사용하여 검출되었습니다. 와인의 유기 영양소 사용의 변화와 박테리아에 미치는 영향을 테스트했습니다. Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O로 자극된 Fermaid O 및 Traminette L을 포함하는 Traminette R 탱크. Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 알파 다양성은 균일성의 정도를 결정했습니다. 베타 다양성은 두 가지 처리의 발효 단계에서 박테리아의 변화를 나타냈으며 최종 와인 박테리아는 비슷하게 보였습니다. 이 연구는 16S 앰플리콘 염기서열 분석을 사용하여 와인 생산 중 박테리아 변화를 모니터링하여 와인 생산 중 포도 박테리아의 품질과 더 나은 활용을 지원할 수 있음을 확인했습니다.

Traminette grape is characterized by production of superior wine quality, in addition to appreciable yield and partial resistance to several fungal infections1,2,3. The natural fermentation of grapes relies on associated microorganisms, wine production environment, and fermentation vessels4,5. Oftentimes, many wineries rely on wild yeast and bacteria for fermentation, production of alcohol, esters, aroma, and flavor development6.
The goal of this study is to examine the bacterial composition of grapes and monitor their dynamics during fermentation. Although, the modern use of starter cultures such as Saccharomyces cerevisiae for primary fermentation, where alcohol is produced, is common to different wine styles7. In addition, secondary fermentation, where malic acid is decarboxylated by Oenococcus oeni to lactic acid, improves the organoleptic and taste profile of the wine and reduces the acidity of wine8,9. With the recent advances in the use of culture-independent methods, it is now possible to determine different microbes associated with the wine grape and the species that are transferred to must and participate in the fermentation at different times up to the final product10.
The roles and dynamics of wild bacteria from different grapes transferred to the must during wine fermentation are poorly understood. The taxonomy of many of these bacteria is not even known, or their phenotypic properties are uncharacterized. This makes their application in coculture fermentation still poorly underutilized. However, microbiological culture-based analysis has been used to determine the bacterial population associated with grapes and wine10. It is widely known that selective culture plating is tedious, prone to contamination, has a low reproducibility, and output can be doubtful; it also misses bacterial species whose growth requirements are unknown. Previous studies indicate that culture-independent, 16S rRNA gene-based methodologies offer a more dependable and cost-effective approach to characterizing complex microbial communities11. For example, sequencing the hypervariable regions of the 16S rRNA gene has been successfully employed to study bacteria in grapes leaves, berries, and wine12,13,14. Studies have shown that the use of either 16S rRNA metabarcoding or whole metagenomic sequencing is suitable for microbiome studies15. There is emerging information about the possible linkage of bacterial diversity to their metabolic attributes during wine production, which could help in the determination of oenological properties and terroir16.
The need to maximize the advantages of the metagenomic tools using next-generation sequencing (NGS) to study the grape and wine microbial ecology has been emphasized16,17. Also, the use of culture-independent methods based on high throughput sequencing to profile microbial diversity of the food and fermentation ecosystem has become very relevant and valuable to many laboratories and is recommended for industrial use18,19. It provides an advantage of detection and taxonomic profiling of the present microbial populations and the contribution of environmental microbes, their relative abundance, and alpha and beta diversity20. The sequencing of the variable region of the 16S region has become an important gene of choice and has been used during different microbial ecological studies.
While many studies focus on fungi, especially yeast, during wine fermentation21, this study reported the 16S amplicon sequencing and bioinformatic tools used to study the bacteria during Traminette grapes fermentation for wine production.

저자 스포트라이트: 차세대 염기서열분석(Next-Generation Sequencing)을 통한 발효 마이크로바이옴 탐구

메타게놈 앰플리콘 염기서열분석(Metagenomic Amplicon Sequencing)을 사용한 와인 생산 중 발효 트라미네트 포도의 박테리아 군집 프로파일링

Research scope focuses on the understanding of the fermentation microbiome. This is to answer questions such as how diverse microbes in natural fermentation are, and what gene coding for metabolite is necessary for flavor and safety. One of the latest advancement in our field involves understanding how the dynamics of the microbiome correlate with the metabolic profile observed in fermented foods and beverages.The next generation sequence stands out as a pivotal technology that is currently driving advancements in our research field

포도에서 추출한 DNA의 양과 질, 발효 와인, 최종 와인이 먼저 결정되었습니다. 수량 값의 범위는 15-87ng/μL입니다(표 1).
염기서열분석 및 생물정보학 Illumina 고처리량 시퀀서는 Nephele로 가져와서 QIIME 2 플랫폼26에서 볼 수 있는 FASTQ 파일을 생성했습니다. 첫째, FastQC 소프트웨어를 사용하여 시퀀스 품질을 확인했습니다. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing at JoVE.com

여기에서는 트라미네트 포도, 발효 포도 및 최종 와인의 박테리아 군집을 결정하기 위한 앰플리콘 메타게놈을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

연구 범위는 발효 마이크로바이옴에 대한 이해에 중점을 둡니다. 이것은 자연 발효에서 미생물이 얼마나 다양한지, 맛과 안전성을 위해 대사 산물에 대한 유전자 코딩이 필요한지와 같은 질문에 답하기 위한 것입니다. 우리 분야의 최신 발전 중 하나는 마이크로바이옴의 역학이 발효 식품 및 음료에서 관찰되는 대사 프로필과 어떻게 상관관계가 있는지 이해하는 것입니다.차세대 염기서열은 현재 우리 연구 분야의 발전을 주도하고 있는 중추적인 기술로 두각을 나타내고 있습니다

profiling-bacterial-community-fermenting-traminette-grapes-during

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

501 조회수.  Appalachian State University. 연구 범위는 발효 마이크로바이옴에 대한 이해에 중점을 둡니다. 이것은 자연 발효에서 미생물이 얼마나 다양한지, 맛과 안전성을 위해 대사 산물에 대한 유전자 코딩이 필요한지와 같은 질문에 답하기 위한 것입니다. 우리 분야의 최신 발전 중 하나는 마이크로바이옴의 역학이 발효 식품 및 음료에서 관찰되는 대사 프로필과 어떻게 상관관계가 있는지 이해하는 것입니다.

비디오: 저자 스포트라이트: 차세대 염기서열분석(Next-Generation Sequencing)을 통한 발효 마이크로바이옴 탐구

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have facilitated a better understanding of both culturable and non-culturable microbes in grapes and wine. During industrial fermentation, microbes, known and unknown, are often responsible for product development and off-flavor. Therefore, profiling the bacteria from grape to wine can enable an easy understanding of in situ microbial dynamics. In this study, the bacteria of Traminette grapes must undergoing fermentation, and the final wine were subjected to DNA extraction that yielded 15 ng/&#181;L to 87 ng/&#181;L. The 16S amplicon of the hypervariable region of the V4 region was sequenced, relatively abundant bacteria consisting of phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota and followed by the Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota, and Acidobacteriota. A Venn diagram analysis of the shared unique operational taxonomic units (OTU) revealed that 15 bacteria phyla were common to both grape must, fermenting stage, and final wine. Phyla that were not previously reported were detected using the 16S amplicon sequencing, as well as genera such as Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae. Variation in the organic nutrient use in wine and its impact on bacteria was tested; Traminette R tank containing Fermaid O and Traminette L stimulated with Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alpha diversity using the Kruskal-Wallis test determined the degree of evenness. The beta diversity indicated a shift in the bacteria at the fermentation stage for the two treatments, and the final wine bacteria looked similar. The study confirmed that 16S amplicon sequencing can be used to monitor bacteria changes during wine production to support quality and better utilization of grape bacteria during wine production.

Here, we present a protocol to describe amplicon metagenomic for determining the bacterial community of Traminette grapes, fermenting grapes, and final wine.

연구

생물학

DNA Extraction from Fermented Grape for Metagenomic Analysis

To begin, transfer 20 milliliters of the fermented grape sample into a sterile 50 milliliter screwed cap tube. Then add 10 milliliters of cold water into the tube and vortex for homogenization. Centrifuge the sample at 800 G for one minute at four degrees Celsius.Transfer the supernatant to a new 50 milliliter tube and centrifuge at 3000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in one milliliter of PBS. Transfer the cell suspension to a two milliliter screw cap tube and centrifuge at 14, 000 G for two minutes.Now resuspend the pellet in 978 microliters of sodium phosphate buffer of pH 7.4 and 122 microliters of DNA buffer. Vortex the tube and place it at four degrees Celsius for 45 minutes to one hour. Transfer one milliliter of the sample into a lysis solution one tube and tighten the cap.Homogenize the sample three times in a bead beating grinder for 60 seconds each. Then centrifuge the lysing matrix E tube for one minute at 16, 800 G.Transfer the supernannt into a clean microtube and add 250 microliters of protein precipitation solution to the tube. Shake the tube 10 times to mix the contents.Centrifuge the sample for five minutes at 16, 800 G and transfer the supernatant into a sterile 15 milliliter tube. Then add one milliliter of binding matrix suspension to the supernatant and mix by inverting the tubes for two minutes before placing them in rack for three minutes. After removing one milliliter of the supernatant, resuspend the matrix in the remaining supernatant.Transfer 600 microliters of the mixture into a spin filter tube and centrifuge. Then decant the flow through and add 500 microliters of wash solution into the spin filter tube. Remove the spin filter and place it in a fresh catch tube for five minutes.After drying, add 50 microliters of warm DNAse-free water on the filter membrane and gently stir the matrix with a pipette tip. Centrifuge at 14, 500 G for one minute to elute the DNA. Load the sample onto an agarose gel.Finally, measure the DNA concentration.

메타게놈 분석을 위한 발효 포도에서 DNA 추출

High-Throughput Sequencing and Bioinformatic Analysis in Grape Must and Wine for Microbial Diversity

To begin, use specific primers 515f and 806r to amplify the V4 hypervariable region of the 16S rNA gene. Perform PCR using the given conditions. Next, add 3.5 microliters of sequencing buffer and 1.5 microliters of enzyme mix to the tube.After mixing and spinning the sample, set up a thermocycler reaction. Now, add the adapter ligation mixture into the tube and incubate at 20 degrees Celsius for 15 minutes in a thermocycler. Add 1.5 microliters of uracil specific extension reagent enzyme to the ligation mix, and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes.Now, add 43.5 microliters of magnetic beads to the adapter ligation DNA and mix 20 times. After five minutes, place the tube in a magnetic rack for five to 10 minutes for bead separation and discard the supernatant. Wash the pellet with 100 microliters of 80%ethanol and dry the beads for 30 seconds.To elute the beads in pellet, add 8.5 microliters of 10 millimolar Tris HCl into the tube and incubate for two minutes. Place the tube in a magnetic rack and remove 7.5 microliters of eluded DNA as supernatant into a new tube. Add PCR reagents to the adapter ligated DNA containing tube to set up a 25 microliter reaction.To clean amplified DNA, add 22.5 microliters of magnetic beads into the tube and mix 20 times. After five minutes, remove 50 microliters of supernatant and wash the beads with 100 microliters of 80%ethanol. Resuspend he dark brown beads in 16 microliters of water and mix 20 times.Place the tube in the magnetic rack for 30 to 60 seconds and transfer 15 microliters to a new tube. Mix 90 microliters of buffer, one microliter of dye, and two microliters of DNA library sample and read the DNA concentration on a fluorimeter. After diluting the DNA to two nanomolar, load 27 to 30 microliters of the flow cell and place it in the sequencer.Save the FASTQ files obtained from the sequencer. Click to open a spreadsheet file and create a mapping or metadata file. Open the Nephele website, upload the FASTQ files, and read QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.Next, using DADA2, execute demultiplexed paired-end reads, filter substitution, chimera errors, and merging. Use the Naive Bayes classifier trained on the Silva version 132 99%operational taxonomic unit, or OTU database, to perform bacterial taxonomic assignment at 97%similarity. Open the MicrobiomeDB website.Click to upload the files, and generate OTU alpha diversity, beta diversity, relative abundance, and rarefaction curves. Finally, open a spreadsheet and transfer data to make heat maps, Venn diagrams, and linear discriminant analysis effect size. A heat map based on the relative abundance of bacteria at different stages of winemaking displayed the dominance of phyla such as Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, and Fusobacteriota.At the genus level, important genera like Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae were identified. A Venn diagram analysis revealed 15 shared unique OTUs from the grape must to the final wine. The results of the amplicon sequencing based on the V4 variable region also indicated the alpha diversity in the two traminette R and L.Beta diversity analysis showed a shift in bacteria during fermentation, but the bacterial composition in the final wine was similar to that in the must and yeast added stages.