시작하려면 물에 1밀리리터당 1밀리그램의 콜라겐 IV 용액을 준비하고 이 용액 95마이크로리터를 10웰 이미징 하단 챔버 슬라이드의 각 웰에 추가합니다. 슬라이드를 섭씨 37도에서 30분에서 2시간 동안 배양하여 우물을 코팅합니다. 배양된 3D 인간 장 오가노이드에서 마지막 통과 후 5-7일 후에 웰에서 WRNE 유지 배지를 제거합니다.
그런 다음 웰당 500밀리몰 EDTA를 포함하는 1xPBS 0.5마이크로리터를 추가합니다. 사전 코딩된 1밀리리터 팁을 사용하여 피펫을 부드럽게 하여 플레이트에서 BMM을 분리합니다. 서스펜션을 사전 코딩된 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
PBS EDTA 용액 500마이크로리터를 추가로 사용하여 각각을 잘 헹굽니다. 현탁액을 원심분리하고 상층액과 잔류 BMM을 제거합니다. 그런 다음 사전 코딩된 팁을 사용하여 5밀리몰 EDTA를 포함하는 3밀리리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시킵니다.
다시 원심분리하고 2밀리리터의 효소 해리 완충액에 재현탁시킵니다. 튜브를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 10% FBS가 함유된 CMGF 3ml를 넣고 부드럽게 섞습니다.
원심 분리하고 펠릿에 CMGF 1 밀리리터를 첨가하십시오. 혼합물을 80-100회 세게 피펫팅하여 오가노이드를 단일 세포로 분해합니다. 펠릿을 원심분리하고 WRNE 배지 1밀리리터에 재현탁시킵니다.
세포 수를 구하고 세포 현탁액을 희석하여 100 마이크로 리터의 5 개 세포에 1.25 곱하기 10을 달성합니다. 다음으로, 우물 바닥을 만지지 않도록 미리 준비한 접시에서 콜라겐 용액을 제거합니다. 그런 다음 웰당 준비된 세포 용액 100마이크로리터를 추가합니다.
섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 매질을 합류할 때까지 24시간마다 웰당 100mL의 분화 배지로 교체합니다. 이 시점 이후에는 단층이 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 된 것입니다.
