먼저 형광단 접합 EV-microRNA 및 cell-microRNA로 transfection된 Calu6 세포를 채취합니다. 둥근 바닥 폴리스티렌 FACS 튜브에 포함된 35마이크로미터 스트레이너 캡을 통해 셀 현탁액을 여과합니다. 그런 다음 유세포 분석 기기를 설정하고 유세포 분석기를 켜고 30분 동안 예열한 후 사용하십시오.
피복 유체로 유체 시스템을 프라이밍합니다. 그런 다음 레이저 정렬을 확인하고 조정합니다. 품질 관리를 위해 초순수 여과수를 유세포 분석기에 넣고 적절한 유속으로 실행하여 적절한 획득 시간을 보장합니다.
그런 다음 FSC 5, 000에서 Calu6 셀의 신호를 캡처하기 위한 임계값을 설정합니다. 형광단 간의 스펙트럼 중첩을 설명하려면 transfection되지 않은 세포와 하나의 fluorophore로만 transfection된 세포를 사용하여 보정 대조군을 준비합니다. 각각 258, 192, 269 및 423 전압 단위로 설정된 FSC, SSC, FITC 및 PE 채널을 사용하여 transfection된 세포에서 발현 분석을 수행합니다.
그런 다음 음성 대조군 샘플을 유세포 분석기에 주입합니다. 사용자 지정 워크시트에서 FSC 및 SSC 농도를 정의한 후 세포 신호를 캡처합니다. 플롯에서 X축으로 FSC를 선택하고 Y축으로 SSC를 선택합니다.
관심 있는 인구 주위에 다각형을 그려 축에 게이트를 만듭니다. 게이트 모집단을 사용하여 새 플롯을 만들려면 X축을 형광 신호 1로 설정하십시오. 세포-microRNA 검출 및 Y축-형광 신호 2 EV-microRNA 검출용.
형광 표지된 각 microRNA로 독립적으로 transfection된 세포를 사용하여 개별 형광단에 대한 보상 파라미터를 설정합니다. cell-microRNA 및 EV-microRNA로 transfection된 세포의 유세포 분석 결과 EV-microRNA에 해당하는 형광 신호의 순차적 감소가 나타났습니다. 대조적으로, 세포-microRNA에 해당하는 신호는 세포에 유지되었으며, 이는 형광단이 세포에 의한 microRNA의 머무름에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.
