먼저 Calu6 세포에서 분리한 EV를 형광단 접합 EV-마이크로 RNA 및 세포-마이크로 RNA로 transfection합니다. EV를 적절한 양의 초미세 여과된 PBS에 희석하여 유세포 분석을 위한 세포외 소포체 현탁액을 준비합니다. 나노 유세포 분석기를 사용하여 나노 크기의 입자를 분석합니다.
소프트웨어를 실행하고 권장 교정 지침에 따라 기기를 구성합니다. 성능 나노 비드를 사용하여 성능 테스트를 수행합니다. 기기의 성능은 나노 비드가 표준 크기 범위 내에서 검출되는 경우 최적의 것으로 간주됩니다.
EV 입자 감지에 적합한 유량을 결정합니다. 이제 초순수 여과수를 사용하여 품질 관리 검사를 수행하여 기기 유체를 검증하고 검출기 및 레이저의 성능을 평가합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 비드 혼합물에 있는 다양한 모집단의 민감도와 분리능을 평가하도록 매개변수를 구성합니다.
그런 다음 적절한 게이팅을 적용하여 비드 모집단을 기기 노이즈와 구별합니다. 다음으로, 분석을 위해 EV를 로드하기 전에 EV의 균일한 분포를 보장하기 위해 샘플을 철저히 소용돌이칩니다. 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 실행하고 초미세 여과 PBS를 도입하십시오.
초미세 필터링된 PBS를 사용하여 EV 입자에 대한 게이팅을 설정하여 게이팅이 보정에 따라 적절한 입자 크기에 해당하도록 합니다. 조율된 호환 튜브에서 전송 및 볼텍싱된 EV를 가져와 튜브를 기기에 로드합니다. x축에 FSC를 플로팅하고 y축에 SSC를 플로팅하면서 EV 신호를 캡처합니다.
x축의 cell micro RNA 검출의 경우 형광 신호 1을 선택하고 y축의 EV micro RNA 검출의 경우 형광 신호 2를 선택합니다. 단일 마이크로 RNA로 transfection된 세포에서 분리한 EV 샘플 사용. fluorophores에 대한 보정 매개변수를 설정했습니다.
유세포 분석은 효율적인 패키징 및 방출을 지원하는 EV에서 miR-451a, Alexa fluor-488의 시간 의존적 축적을 보여주었습니다. 대조적으로, miR-67 셀의 형광은 EV에서 관찰되지 않았습니다.
