암 진단을 위한 나노센서 특성화 및 CRISPR-Cas 매개 소변 바이오마커 검사

시작하려면 2 밀리그램의 다가 PEG를 말레이미드 반응성 그룹과 1 밀리리터의 100 밀리몰 인산염 완충액으로 녹입니다. 0.2마이크로미터 필터를 통해 용액을 여과합니다. 시스테인 종결 DNA 펩타이드 접합체를 용액에 첨가합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 비접합 물질을 제거합니다. PBS에서 샘플을 실행합니다. DNA와 펩타이드를 검출하기 위해 흡광도를 모니터링합니다.

샘플을 원심 필터 튜브에 넣고 제조업체의 권장 속도에 따라 원심분리하여 합성된 나노센서를 농축합니다. 96웰 플레이트를 맞춤형 하우징 챔버의 베이스로 사용하십시오. 기준선 측정을 위해 소변을 수집하려면 먼저 하우징 챔버에 마우스를 놓습니다.

구속된 쥐의 방광에 부드러운 압력을 가하여 남아 있는 소변을 접시로 배출합니다. 채취한 소변을 1.5밀리리터 튜브에 피펫팅합니다. 멸균 PBS에서 200마이크로리터의 나노센서 주입 용액을 준비합니다.

각 마우스에 200마이크로리터의 용액을 정맥 주사합니다. 주입 1시간 후 대조군 및 실험용 마우스에서 소변 샘플을 수집합니다. DNA 바코드의 형광 기반 CRISPR 검출을 위해 소변 샘플을 실온에서 5분 동안 800G로 원심분리합니다.

이제 CRISPR 시약을 결합한 다음 Cas12a 효소를 첨가한 후 반응 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 FRET 기반 리포터 DNA 혼합물을 사용하여 리포터 반응을 실행합니다.

혼합물을 384웰 플레이트에 넣고 3시간 동안 2분마다 섭씨 37도에서 형광을 즉시 측정하여 분할 역학을 모니터링합니다. 종이 기반 CRISPR 검출을 수행하려면 FAM-Biotin 표지된 DNA 리포터를 사용하여 CRISPR 반응 배양 후 대체 리포터 반응을 실행합니다. 시약을 96웰 플레이트에 결합한 후 알루미늄 호일로 덮은 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.

이제 80 마이크로 리터의 PBS를 96 웰 플레이트의 신선한 웰에 추가합니다. 이 우물에 20 마이크로 리터의 리포터 반응 혼합물을 피펫팅합니다. 측면 흐름 종이 스트립을 각 웰에 놓고 액체가 스트립 상단에 도달할 때까지 기다립니다.

화학적으로 변형된 단일 가닥 DNA는 변형되지 않은 이중 가닥 DNA 및 단일 가닥 DNA에 비해 Cas12a 활성화를 보여주었습니다. 처리되지 않은 소변의 변형된 DNA 분자는 측면 유동 종이 스트립에서 비색 판독값을 보여주었습니다. 주요 샘플 밴드는 소변 DNA에 의해 유발된 리포터 분열을 통해 검출 가능한 FAM의 방출을 나타냈습니다.