Murine Dermis에서 세포 분리

70% 에탄올로 적절하게 면도하고 소독한 안락사된 쥐에 대해 생물 안전 캐비닛 내부에서 프로토콜을 수행합니다. 가위를 사용하여 동물의 복부에 0.5인치의 표재성 절개를 만듭니다. 정중선을 따라 목과 하복부를 향해 세로로 자릅니다.

또한 피부를 플랩으로 열 수 있도록 측면 절단을 하십시오. 뭉툭한 집게를 사용하여 피부를 주변 조직과 부드럽게 분리하면서 동물의 몸통 주위를 돌면서 목 주위와 하복부 주변의 피부를 측면으로 자릅니다. 진피 쪽이 아래를 향하도록 피부를 100mm 조직 배양 플레이트에 조심스럽게 놓습니다.

그리고 피부가 최대한 늘어나도록 하십시오. 접시에 Dispase 용액 6ml를 추가하여 피부가 완전히 덮이도록 합니다. 그런 다음 접시를 덮습니다.

파라 필름으로 접시를 감쌉니다. 식재를 평평하게 하기 위해 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 피펫을 사용하여 분리 된 피부가 들어있는 접시에서 액체를 제거하십시오.

그런 다음 겸자를 사용하여 표피에서 진피를 분리하면서 눈에 보이는 지방 조직을 제거합니다. 그리고 분리된 진피를 깨끗한 조직 배양 플레이트에 넣습니다. 1X 항생제-항진균 용액이 포함된 DMEM 1mL를 배양 플레이트의 진피에 추가합니다.

접시를 기울여 접시의 한쪽 면에 액체를 축적합니다. 그런 다음 진피를 1-2 평방 밀리미터 조각으로 다집니다. 그리고 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

10ml의 콜라겐분해효소 II형 용액을 튜브에 추가합니다. 진피를 소화시키기 위해 30-50 rpm에서 지속적으로 교반하면서 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 70미크론 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과합니다.

그리고 250g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 항생제-항진균 용액이 포함된 10mm의 DMEM에 펠릿을 재현탁시킵니다. 앞에서 설명한 것처럼 원심분리하기 전에 40미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.

생성된 세포 펠릿을 1밀리리터의 완전한 LEC 매체에 재현탁시킵니다. 그런 다음 콜라겐으로 코팅된 60mm 조직 배양 플레이트에 완전한 LEC 배지로 세포를 플레이트합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 새 LEC 배지를 추가하여 이틀에 한 번씩 배지를 교체합니다.

쥐 진피에서 분리한 세포의 저배율 이미지는 혼합된 세포 집단을 보여주었습니다.