Murine Lymphatic Endothelial Cell 정제

소변 림프 내피 세포를 정제하기 위해, 약 80-90%Co-fluency에 도달한 후 쥐 진피에서 분리된 세포를 사용하고, 1밀리리터의 자기 비드 코팅 용액을 사용하여 자기 분리기에서 사전 코딩된 자성 비드를 세척하는 것으로 시작합니다. 0.1% BSA를 함유한 150마이크로리터의 DMEM에 비드를 재현탁시킵니다. 다음으로, PBS로 60mm 조직 배양 플레이트의 세포를 두 번 세척합니다.

50 마이크로리터의 항체 접합 비드를 0.1% BSA가 함유된 3 밀리리터의 DMEM과 혼합하여 세포에 첨가합니다. 생물막으로 접시를 밀봉한 다음 실온에서 10RPM으로 정확히 10분 동안 교반하는 셰이커에 접시를 배양합니다. PBS로 세포를 한 번 세척하기 전에 배지를 버리십시오.

세포를 신속하게 검사하여 플레이트에 LEC 콜로니가 있는지 확인합니다. 세포에 트립신 EDTA 1밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양하여 세포를 트립신화합니다. 성공적인 세포 분리를 위해 세포를 검사합니다.

2 밀리리터의 완전한 LEC 매체로 용액을 중화 한 후. 세포 용액을 5밀리리터의 멸균 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다. 자기 분리기를 사용하여 0.1% BSA가 포함된 3밀리리터의 DMEM으로 세포를 세척하여 결합되지 않은 세포를 제거합니다.

나머지 비드 결합 세포를 완전한 LEC 배지에 재현탁시키고 콜라겐 코팅된 60mm 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다. 명시야 및 형광 이미징은 정제 후 LYVE1 양성 림프 내피 세포를 쉽게 식별하고 여러 개의 비드가 부착되어 있음을 보여주었습니다. 세포는 정제 후 24시간 후에 낮은 밀도를 보인 반면, 정제 7일 후에는 매우 유창한 농도를 보였습니다.