시작하려면 살아있는 Caenorhabditis elegans에서 DA9 축삭의 비시냅스 영역에서 내인성 GFP Rab3의 타임랩스를 기록합니다. 타임랩스 데이터 파일을 피지로 가져옵니다. 그런 다음 이미지 획득 중 동물 또는 축삭 세그먼트의 움직임이나 약간의 드리프트를 확인합니다.
StackReg 플러그인을 강체 변환 옵션과 함께 사용하여 움직임이나 드리프트를 수정할 수 있습니다. 분할된 선 도구를 사용하고 축삭 직경과 일치하도록 선 너비를 조정합니다. 세그먼트된 선 아이콘을 마우스 왼쪽 버튼으로 두 번 클릭하여 분석을 위해 축삭 세그먼트를 따라 선을 그립니다.
이제 Fiji 플러그인 KymoResliceWide를 사용하여 kymograph를 생성하고 매개변수 설정에서 선 너비에 걸쳐 최대 강도 값을 설정합니다. 직선 도구를 사용하여 kymograph에서 수송 이벤트를 추적합니다. 개별 전송 이벤트를 추적하고 각 라인을 ROI 관리자에 저장합니다.
피지에서는 면적, 경계 사각형, 평균 회색 값 및 Feret의 지름과 같은 측정 매개 변수를 선택합니다. 그런 다음 계산을 위해 결과 테이블을 스프레드시트에 붙여넣습니다. 너비에 카메라 해상도를 곱하여 실행 길이(마이크로미터)를 구합니다.
이동 이벤트의 지속 시간을 결정하려면 높이에 연속된 시점 사이의 획득 시간을 곱합니다. 일시 중지 시간을 속도가 0인 두 개의 연속 이동 사이의 실행 기간으로 계산합니다. 분당 이벤트 수 및 축삭 길이 세그먼트에 대한 키모그래프의 총 길이로 총 이벤트를 정규화합니다.
Ferret angle 도구를 사용하여 이벤트를 전방 수송과 역행 수송으로 분류합니다. 근위부에서 원위부까지 분할된 선을 그려 생성된 카이모그래프의 경우 Feret 각도를 사용하여 각 이벤트의 방향성을 결정합니다.
