1 시작하려면관심 있는 halo-tagged 단백질과 halo H2B를 발현하는 리간드 염색 세포 2를 얻습니다. 3 현미경 시스템을 켠 후 4 살아있는 세포 배양 매개변수 5를 설정하고 시스템이 평형을 이루도록 합니다. 6 현미경 7의 100x TIRF 대물렌즈 8에 오일 한 방울을 떨어뜨리고 세포 샘플을 현미경 스테이지에 로드합니다.
9 형태학적으로 건강한 세포를 식별하기 위해, 10 Z 위치 11을 조정하고 명시야 조명 아래에서 세포 샘플을 이미지화합니다. 12 시야를 잘라 대상 세포핵을 캡처합니다. 13 레이저 조명을 사용하여 TIRF 각도(14)를 조정하여 단일 분자의 최적 15 신호 대 잡음비로 힐로 조명을 얻습니다.
16 그런 다음 노출 시간을 500밀리초로 설정합니다. 17 프레임 사이의 데드 타임 동안, 18 사진은 111 마이크로 와트 405 나노 미터 빔으로 분자 (19)를 활성화하고, 20 각 노출 동안, 9.1 밀리 와트 640 나노 미터 빔으로 H2B 헤일로 분자 (21)를 자극합니다. 22 연속적으로 2000 프레임에 대한 이미지 캡처를 시작하고(23) 사진 활성 분자의 감소에 따라 405나노미터 빔(24)의 전력을 점차적으로 증가시킨다.
25 관심 있는 후광 태그 단백질의 경우, 26은 장역 통과 이색성 거울을 사용하여 27개의 카메라 간에 방출 파장을 분할합니다. 28 앞에서 시연된 동일한 획득 매개변수에 29는 JFX549 채널을 추가하여 10초 30마다 하나의 프레임을 획득하고 2000프레임을 연속적으로 캡처합니다.
