1 시작하려면HaloTag 단백질 응축물의 라이브 셀 2 단일 분자 이미징을 수행합니다. 3 ImageJ를 사용하여 원시 이미징 데이터 파일 5의 각 채널 4를 독립적인 TIFF 파일로 변환합니다. 6 필요한 경우 사전 추적 빗을 실행합니다.
텍스트 7을 입력하고 프롬프트 8에 따라 모든 프레임을 가장 최근의 프레임으로 교체합니다. 9 SlimFast에서 영화 파일의 단일 분자를로드하려면 10로드를 클릭 한 다음 이미지 스택을 클릭하십시오. 11 각 옵션 시트에서 지역화 12 및 획득을 위한 매개변수를 설정합니다.
13 모든 분자의 국소화를 시각화합니다. 도 14를 참조하면, 15는 모든 프레임에 있는 모든 분자의 국소화(16)를 포함하는 파일을 생성한다. 17 다음으로, 입자 데이터 로드(18)로 이동하여 SlimFast를 선택하여 위치 파악 및 획득 설정이 있는 파일(19)을 로드합니다.
20 옵션 및 시트 추적을 사용하여 21은 궤적 생성을 위한 매개변수를 조정합니다. 22 gen traj를 클릭하여 모든 분자의 궤적을 포함하는 파일 23을 생성합니다. 24 시트 추적 파일을 평가 SPT 25에 로드하고 매개변수 26을 설정하여 2.5초 미만의 궤적을 필터링합니다.
27 내보내기 데이터를 사용하여 필터링된 모든 궤적이 포함된 파일 28을 생성합니다. 29 ImageJ 매크로, 핵, 30 및 클러스터 마스크 버전 2 실행. 텍스트, 31 임계값: 영화의 모든 프레임이 JFX549 채널에서 32를 획득하여 응축수 위치를 강조하는 시간 진화 이진 마스크(34)로 채워진 타임랩스 동영상(33)을 생성한다.
35 ASCII 느린 추적 CSS 변환 사용 3. M, 36은 궤적 37을 다시 포맷하고 범주화 버전 4를 실행합니다. M 38 분자가 응축수에서 보내는 수명 39를 기준으로 분류합니다.
40 다음으로, 플롯 거주지 hist CSS를 사용합니다. M, 41은 특이적으로 결합된 분자(43)의 관찰된 해리 속도(42) 및 관심 있는 응축물(44) 단백질 및 H2B 궤적으로부터 광표백 속도를 추출한다. 45 마지막으로, 관심 단백질의 보정된 평균 체류 시간(46)을 계산하고, 47은 그의 응축물에 특이적으로 결합된다.
48 TAF15 IDR-Halo-FTH1의 2색 단일 분자 영화 49의 프레임은 PA-JF646 및 JFX549 채널 모두에서 핵으로부터의 신호(50)를 보여줍니다. 51 조립 및 분류 시, 52 PA-JF646의 궤적(53)이 응축수에 결합된 분자를 검출하는 데 명확한 구별이 관찰되었습니다. 54 광표백(56)에 대한 보정 후 계산된 평균 체류 시간(55)은 TAF15-Halo-FTH1이 Halo-TAF15보다 더 많았다.
