항원 코팅을 시작하려면 코팅 완충액으로 오브알부민을 밀리리터당 5마이크로그램으로 희석합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 웰당 100마이크로리터의 오브알부민 용액으로 96웰 ELISA 플레이트를 코팅합니다. 다음 날, PBST로 우물을 5 번 씻으십시오.
섭씨 37도에서 2시간 동안 250마이크로리터의 1% BSA PBST로 우물을 막습니다. 1000 X 혈청 희석액을 준비하려면 먼저 0.5% BSA PBST를 사용하여 20마이크로리터의 혈청을 1밀리리터로 희석합니다. 그런 다음 25 마이크로 리터의 혈청 분취액을 제거하고 0.5 % BSA PBST를 사용하여 500 마이크로 리터로 희석합니다.
1000 X로 희석된 혈청 200마이크로리터를 코팅된 플레이트의 첫 번째 줄에 추가합니다. 그런 다음 첫 번째 줄의 웰을 제외한 모든 웰에 0.5%BSA PBST 100마이크로리터를 추가합니다. 첫 번째 줄에서 두 번째 줄로 100 마이크로 리터를 옮기고 10 번 섞습니다.
IgG 검출을 위해 다양한 농도의 혈청을 생성하려면 마지막 줄에서 100마이크로리터의 액체를 버리십시오. 다음으로, 0.5% BSA PBST로 생쥐 질 세척액, 기관지 폐포 세척액, 비강 세척액을 희석하고 20% 태아 종아리 혈청 PBST로 소장 세척액을 희석합니다. 접시를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다.
PBST로 우물을 5번 씻으십시오. 100 마이크로리터의 HRP 접합 염소 항 마우스 항체를 적절한 웰에 넣고 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다. PBST로 웰을 5회 세척한 후 TMB ELISA 기질 100마이크로리터를 첨가하고 빛이 차단된 지역에서 5분 동안 배양합니다.
100 마이크로 리터의 450 나노 미터 정지 용액을 첨가하여 반응을 종료합니다. 마이크로플레이트 리더에서 450나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 양성 반응 값을 대조군 마우스 그룹의 혈청 값의 2.1배로 정의하는 항체 역가를 계산합니다.
나노 에멀젼 보조제 백신은 혈청 내 오브알부민 특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a 항체 역가를 크게 증가시켰습니다. 질 세척액과 소장 세척액의 특이 IgA 수치는 오브알부민을 양이온성 나노에멀젼 캡슐화된 레티노산으로 보강했을 때 크게 향상되었습니다.