먼저 원시 264.7 세포를 100mm 배양 접시에 넣고 섭씨 37도에서 습도 95%, 이산화탄소 5%에서 6ml의 DMEM으로 배양합니다. 세포가 80% 밀도에 도달하면 기존 배지를 흡인한 다음 실온으로 데운 PBS 2밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 세포가 들어있는 각 접시에 PBS 2ml를 넣고 섞습니다.
세포를 두 개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 모은 다음 실온에서 3분 동안 377G로 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS 2밀리리터에 재현탁시킵니다. 이제 흰색 고체가 형성될 때까지 미세 원심분리기 튜브를 액체 질소에 얼린 다음 섭씨 37도의 수조에서 즉시 해동합니다.
12, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 관을 분리한다. 다음으로, 두 개의 마이크로 원심 분리기 튜브를 가져 가는데, 하나는 100 마이크로 몰 Xanthatin이 있고 다른 하나는 동일한 부피의 dimethyl sulfoxide가 있습니다. 각 튜브에 450마이크로리터의 원심분리된 상층액을 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 각 마이크로 원심분리기 튜브에서 60마이크로리터의 상층액을 14개의 PCR 튜브로 옮깁니다. 각 온도에서 두 개의 PCR 튜브를 사용하여 3분 동안 다양한 온도에서 튜브를 동시에 가열합니다. 그런 다음 튜브를 원심분리기에 넣습니다.
이제 각 튜브에서 48마이크로리터의 상층액을 채취하여 새로운 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 추가합니다. 각 튜브에 12마이크로리터의 SDS-PAGE 단백질 로딩 버퍼를 추가합니다. 소용돌이 치밀어 넣은 샘플을 섭씨 100도의 수조에서 5분 동안 가열합니다.
