시작하려면 SDS-PAGE 젤을 준비합니다. 해동된 마커와 준비된 세포 열 이동 분석 샘플을 회전시킵니다. 첫 번째 웰에 2.5마이크로리터의 마커를 추가하고 나머지 웰 각각에 20마이크로리터의 샘플을 추가합니다.
그런 다음 젤을 80볼트로 실행합니다. 다음으로 초순수 850ml, 무수 에탄올 100ml, 급속 전달 완충액 50ml를 비이커에 넣고 잘 저어줍니다. 겔의 크기에 따라 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 PVDF 멤브레인을 자르고 표시하십시오.
그런 다음 메탄올에 30초 동안 담가 활성화합니다. 전사 클램프, 스폰지 패드 및 3겹의 전사 필터 용지를 전사 버퍼가 들어 있는 트레이에 넣습니다. 전기 영동이 완료되면 전기 영동 장치에서 전기 영동 용액을 붓고 플레이트를 제거합니다.
플라스틱 칼로 겔을 부드럽게 제거하고 단백질 마커와 표적 단백질을 명확하게 시각화하도록 자릅니다. 막관통 용액에서 겔을 세척한 후 여과지 위에 평평하게 놓습니다. 활성화된 PVDF 멤브레인을 전사 용액에 담궈냅니다.
라벨이 붙은 쪽을 핀셋으로 잡고 젤을 뒤집어 씌웁니다. 그런 다음 조립된 이송 설정을 이송 탱크에 넣습니다. 나머지 막관통 용액을 막관통 카세트에 추가합니다.
현재와 시간을 조정하고 run을 눌러 실온에서 전송을 시작합니다. 이제 TBST가 있는 5% BSA 용액 6밀리리터를 배양 상자에 추가합니다. 전송이 완료되면 마커 쪽을 고정하고 배양 상자에 넣으면서 설정에서 PVDF 멤브레인을 제거합니다.
인큐베이터 상자에서 BSA 용액을 제거한 후 6mL의 1차 항체를 추가합니다. 인큐베이션 박스를 아이스팩이 든 폼 박스에 넣고 흔들면서 밤새 넣습니다. 다음 날, 튜브에 1차 항체를 수집하고 TBST 용액 6ml로 멤브레인을 세척합니다.
그런 다음 배양 상자에 6 밀리리터의 2 차 항체를 추가합니다. 배양이 끝나면 2차 항체를 채취하고 앞서 보였던 것처럼 TBST로 멤브레인을 5회 세척합니다. 화학발광 시약 A와 B를 같은 부피로 혼합하여 겔 이미징 시스템을 엽니다.
샘플을 클릭하고 보정을 확인한 다음 보정이 완료될 때까지 기다립니다. 그런 다음 마커를 클릭하고 보정을 확인하십시오. 이제 핀셋으로 스트립의 마커 쪽을 잡고 화학 발광 시약 용액에 완전히 담그십시오.
Clamp 마커의 한쪽을 눌러 스트립을 이미저에 뒤집어 놓고 이미저의 덮개를 닫습니다. 노출 시간을 1초로 설정하고 캡처를 클릭합니다. 저장을 클릭합니다.
이미지 이름을 지정하고 TIFF 파일로 저장합니다. 세포 열 이동 분석은 Xanthatin이 디메틸 설폭사이드 그룹에 비해 섭씨 48도에서 57도의 온도 범위 내에서 Keap1 단백질의 열 안정성을 현저하게 변화시킨다는 것을 보여주었습니다.
