시작하려면 10ml의 2X AlkB 반응 완충액을 준비하고 0.2미크론 주사기 필터를 통해 멸균합니다. 멸균 PCR 튜브에 링커 1-결찰 RNA 20마이크로리터, 2X AlkB 반응 완충액 50마이크로리터, AlkB 탈메틸효소 2마이크로리터, RNA 억제제 1마이크로리터 및 RNA 활성수 27마이크로리터를 첨가하여 AlkB 분해 반응을 준비합니다. AlkB 분해 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양하여 RNA에서 전사 후 메틸화를 제거합니다.
깨끗한 상 분리를 위해 RNA가 없는 물 50마이크로리터를 AlkB 반응에 첨가합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올 혼합물을 추가합니다. 튜브를 10초 동안 흔듭니다.
16, 10 분 동안 000G에 AlkB 혼합물을 분리한다. 약 140 마이크로리터의 상부 수성층 함유 RNA를 멸균된 1.5 밀리리터 튜브에 전달합니다. 잔류 페놀을 제거하려면 추출된 RNA에 클로로포름 100마이크로리터를 넣고 튜브를 흔듭니다.
16, 10 분 동안 000G에 혼합물을 분리하고 메마른 1.5 밀리리터 관으로 최고 수성 층의 대략 120 마이크로리터를 옮긴다. 역전사 반응 후, 1 마이크로리터의 5몰 수산화나트륨을 RNA cDNA 하이브리드에 첨가합니다. RNA cDNA 하이브리드의 RNA 가닥을 가수분해하기 위해 섭씨 93도에서 3분 동안 배양합니다.
그런 다음 0.77 마이크로 리터의 5 몰 염산을 첨가하여 반응을 중화시킵니다. TAE 완충액에 3%아가로스 겔을 준비한다. 1 마이크로 리터의 6X 로딩 염료를 5 마이크로 리터의 PCR 제품에 혼합하고 혼합물로 겔을로드합니다.
50 또는 100 염기쌍 DNA 사다리 5마이크로리터를 첫 번째 샘플 앞의 웰과 마지막 샘플 뒤의 웰에 로드합니다. PCR 산물을 찾기 위해 75분 동안 120볼트 및 400밀리암페어에서 겔 전기영동을 실행합니다. 전기 영동 후 겔을 상자에 넣고 겔이 완전히 잠길 때까지 탈이온수로 채웁니다.
10마이크로리터의 에티듐 브로마이드를 물에 넣습니다. 상자를 호일로 싸서 셰이커로 30분 동안 얼룩을 냅니다. 브롬화 에티듐 함유 물을 흄 후드에 넣은 폐기물 병에 버리십시오.
탈이온수로 젤을 한 번 헹구고 물을 쓰레기통에 버립니다. 탈이온수로 겔을 10분 동안 세척한 후 겔 이미저를 사용하여 밴드를 시각화하고 겔의 고해상도 이미지를 획득합니다.
