각 샘플에 대해 LB 육수 1m리터와 LB 플러스 겐타마이신 한천 플레이트 1mL를 예열하고 섭씨 37도로 설정된 정적 인큐베이터에서 대조군을 예열합니다. 5 마이크로리터 이하의 결합 부피에서, pTNS2 helper plasmid 및 pUC18-Tmini-Tn7-Tlac gentamicin adeIJK insertion plasmid를 각각 100 내지 200 나노그램을 electrocompetent cell의 분취액에 첨가한다. 손가락 끝으로 가볍게 두드려 혼합하여 기포를 발생시키지 않고 플라스미드와 전기 능력이 있는 세포가 완전히 혼합되도록 합니다.
동일한 양의 멸균 증류수를 음성 대조군 세포 부분 표본에 넣고 이전과 같이 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 전체 세포 샘플을 얼음처럼 차가운 전기천공법 큐벳으로 옮긴 다음 큐벳을 다시 얼음 위에 놓습니다.
셀 샘플을 전기포레이션하려면 electroporator를 켜고 2킬로볼트로 설정합니다. 부드러운 티슈로 큐벳 표면을 닦아 붙은 얼음이나 습기를 제거합니다. 큐벳을 electroporator에 삽입하고 전기 충격을 가하십시오.
즉시 0.9ml의 미리 데워진 LB 육수를 큐벳의 세포에 넣고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 배지와 혼합합니다. 전체 셀 현탁액을 실온에서 새로운 1.5mL 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 electroporator의 시간 상수 값을 확인하십시오.
최상의 결과를 얻으려면 이 값이 4에서 6 사이여야 합니다. 세포 회수를 위해 섭씨 37도에서 250RPM으로 1시간 동안 전기천공된 샘플을 배양합니다. 한 시간 후, 접종 살포기를 사용하여 예열된 LB plus gentamicin 한천 플레이트에 각 샘플 100마이크로리터를 펼칩니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 16-18시간 동안 배양합니다. electroporation 플레이트를 확인하십시오. 멸균 이쑤시개를 사용하여 LB plus 겐타마이신 한천 플레이트에서 최대 10개의 단일 콜로니를 선택하여 새로운 LB 플러스 겐타마이신 한천 플레이트에 패치합니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 16-18시간 동안 배양합니다. 형질전환 플레이트 콜로니를 선택적 배지에 패치하면 형질전환된 균주를 보존하고 콜로니 PCR 스크리닝을 위한 시작 물질을 제공합니다. 스크리닝 프라이머, ABglmS2 순방향 신규 및 Tn7 역방향에 대한 PCR 산물은 382 염기쌍입니다.
반응에 대한 음성 대조군에는 야생형 A.baumannii ATCC 17978, AB 258이 포함되며 주형은 없습니다.
