원심분리기는 5, 4 섭씨 온도에 30 초 동안 000G에 단백질 표본을 표를 붙였다. 구슬이 수평을 이룰 때까지 얼음 위에서 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 상층액을 버리십시오.
프로테아제 억제제가 함유된 단백질 용해 완충액 1mL를 튜브에 넣고 내용물을 혼합합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 약 30초 주기 동안 회전기의 튜브를 회전시킵니다. 다시 원심 분리하고 튜브를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드를 평평하게 한 후 상층액을 버립니다.
이제 10마이크로리터의 샘플 버퍼를 추가하고 샘플을 섭씨 98도에서 10분 동안 끓입니다. 5, 4 섭씨 온도에 30 초 동안 000G에 표본을 분리한다. 단백질 흡수율이 낮은 새 튜브에 컬럼을 넣고 팁이 절단된 피펫을 사용하여 겔을 컬럼으로 옮깁니다.
9, 730G에서 섭씨 4도에서 1분 동안 원심분리기를 넣고 흐름을 수집합니다. 겔을 전기영동 챔버에 넣고 겔 주위에 적절한 부피까지 트리스-글리신-SDS 완충액을 추가합니다. 용리된 단백질 샘플을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다.
100볼트 및 400밀리암페어에서 전기영동을 수행합니다. 겔을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인에 옮기고 실온에서 1시간 동안 5% 탈지유로 멤브레인 블롯을 블롯합니다. PBS 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트로 멤브레인을 셰이커에서 최고 속도로 5분 동안 세 번 세척합니다.
마지막으로 1차 항체가 있는 멤브레인을 섭씨 4도의 셰이커에서 밤새 배양합니다. 형질주입된 HEK 293 세포에서, 면역블로팅은 DYKDDDDK-PRDM16 및 HA-EHMT1로 형질주입된 그룹에서 DYKDDDDK-PRDM16과 HA-EHMT1 사이의 연관성을 확인했다.
