멸균된 튜브를 바이오칩에 연결하기 전에 먼저 200마이크로리터의 PBS로 튜브를 세척한 다음 200마이크로리터의 EC 매체로 세척합니다. 갓 준비된 세포 배양 배지로 상부 및 하부 챔버를 세척한 후 바이오칩의 출구 쪽에 저장소를 삽입하고 튜브가 있는 저장소를 바이오칩의 입구에 연결합니다. 원형 매체 주입을 위해 튜브를 저장소와 바이오칩에 연결합니다.
이제 저장소에 500마이크로리터의 EC 매체를 채웁니다. 바이오칩을 튜브와 연결하여 분당 21마이크로리터의 유속으로 증식을 시작합니다. 다음 날, 풍성함을 멈추고 저수지를 비우십시오.
멸균 안전 캐비닛 아래에서 500 마이크로리터의 EC 배지를 리저버에 피펫팅하고 200 마이크로리터의 RPMI와 배지로 하부 챔버를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 분당 21마이크로리터의 유속으로 관류를 다시 시작합니다. 12일째부터 14일째까지 공기 액체 인터페이스를 설정하려면 하단 챔버의 플러그를 열고 기포가 보일 때까지 매체를 조심스럽게 흡수합니다.
채널과 챔버의 모든 액체가 제거되었는지 확인한 후 포트를 조심스럽게 닫고 저장소에 새로 준비된 혈관 EC 배지를 채우고 14일까지 상부 챔버에서만 증식 배양을 계속합니다. 흐름 시스템에서 바이오칩을 분리합니다. 튜브를 제거한 후 세포 밀도를 위해 현미경으로 바이오칩의 세포층을 검사합니다.
PBS로 바이오칩 캐비티를 세척하여 세포 배양 배지를 제거합니다. PBS의 4% 파라포름알데히드 용액 300마이크로리터를 상부 챔버에 추가하고 하부 챔버에 200마이크로리터를 추가합니다. 배양 10분 후 PBS로 챔버를 세 번 세척합니다.
투과를 위해 PBS에 0.25%Triton X 100 300마이크로리터를 추가하고 PBS로 세척한 후 30분 동안 배양하고 양쪽 챔버에서 PBS에 3% 소 혈청 알부민 300마이크로리터를 피펫팅하고 1시간 동안 배양합니다. 면역형광 염색의 경우 적절한 희석 비율을 사용하여 각 멤브레인에 대해 3%BSA를 사용하는 50마이크로리터의 항체 용액을 준비합니다. 바이오칩 내의 세포에 접근하려면 캐비티 외부를 정확하게 절단하고 접착 호일을 제거합니다.
메스를 사용하여 바이오칩에 밀봉된 가장자리를 제거하여 멤브레인을 잘라냅니다. 멤브레인을 두 조각으로 나눈 후 핀셋으로 멤브레인 조각을 모아 염색을 위해 현미경 슬라이드에 놓고 각 멤브레인 조각에 50마이크로리터의 항체 용액을 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 빛으로부터 보호합니다. PBS로 멤브레인을 세 번 세척한 후 라벨이 부착된 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 추가하고 해당 멤브레인을 놓습니다.
멤브레인 상단에 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 커버 유리를 놓습니다. 인간 제대 정맥 내피 세포의 면역형광 염색은 14일간의 공동 배양 후 형태학적 변화와 마르코단백질 발현을 보여주었습니다. 혈관 측면에서, 내피 세포 경계에서 V 일관성 있는 발현은 밀도와 내피 장벽 형성을 시사했습니다.
상피 측은 에카헤린 및 계면활성제 단백질 A 발현에 대해 평가되었으며, 이는 폐포 상피 무결성 및 기능을 나타냅니다.
