시작하려면 소프트웨어를 열고 새 DNA 파일을 만드는 옵션을 선택하십시오. NCBI에서 PRRSV 유전자 염기서열을 준비하고 확인을 클릭하여 염기서열 파일을 생성합니다. 염기서열을 분석하고 단편 접합을 표시합니다.
단편에 대한 특정 염기서열 프라이머를 설계하기 전에 모든 접합을 식별합니다. 그런 다음 Primers(프라이머)를 클릭하고 Add Primer(프라이머 추가)를 선택합니다. 특정 염기서열을 붙여넣고 벡터의 overlap sequence를 primer의 처음 5개의 프라임 뉴클레오티드에 추가합니다.
포워드 프라이머의 이름을 지정하고 Add Primer to Template(템플릿에 프라이머 추가)을 클릭하여 디자인된 프라이머를 템플릿에 통합합니다. 그런 다음 단편 접합을 표시하고 단편의 역 특정 서열 프라이머를 설계합니다. 다시 Primers(프라이머)로 이동하여 Add Primer(프라이머 추가)를 선택합니다.
특정 시퀀스를 입력합니다. 처음 5개의 프라임 뉴클레오티드에 제한 부위를 추가합니다. 또한, 20 내지 40개의 염기쌍의 벡터 돌출 서열을 제한 부위의 처음 5개의 프라임 뉴클레오티드에 포함시킨다.
리버스 프라이머의 이름을 지정하고 템플릿에 프라이머 추가를 선택합니다. 다음으로, 6개의 단편과 설계된 프라이머 쌍을 사용하여 6개의 개별 PCR 반응을 설정합니다. 다음과 같이 3단계 프로토콜에 따라 PCR을 실행합니다.
PCR 완료 후, 6개의 xDNA 로딩 완충액 1마이크로리터를 PCR 산물 5마이크로리터와 피펫합니다. 간단히 혼합하고 원심분리합니다. 1%아가로스 겔 전기영동을 사용하여 시료를 분석합니다.
전장 유전자를 구성하기 위해, PRRSV의 삽입 단편을 6개의 PCR 반응을 사용하여 증폭하였다. 단편의 크기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인되었다.
