시작하려면 핀셋으로 살모넬라균에 감염된 쥐 조직의 해동된 샘플을 집어 올립니다. 액체 아가로스가 들어있는 플라스틱 틀의 바닥에 빠르게 삽입하십시오. 중합이 완료되면 메스를 사용하여 모서리에서 플라스틱 금형을 엽니다.
마이크로톰에 칼날을 놓은 후 장갑을 낀 손가락으로 샘플을 샘플 상자에 옮깁니다. 아가로스의 상부 표면이 마이크로톰의 블레이드와 같은 높이가 되도록 마이크로톰 아래에 샘플을 배치합니다. 스테이지를 이동하여 아가로스 큐브를 대물렌즈 중앙에 놓습니다.
단층 촬영 소프트웨어에서 Slice 버튼을 클릭하면 큐브의 온전한 전체 절편을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 대물 렌즈를 x 및 y 방향으로 조직 샘플의 중앙에 놓습니다. 레이저 소프트웨어를 실행하고 파장을 800나노미터로 조정한 다음 레이저를 켭니다.
현미경의 캐비닛 도어를 닫습니다. 그런 다음 방의 모든 광원을 끕니다. PMT를 켜고 전압을 750볼트로 설정합니다.
이제 현미경 셔터를 자동으로 설정합니다. 그런 다음 V1과 V2의 전압을 각각 20과 1.71로 설정합니다. 조직 표면에 도달할 때까지 z-piezo 장치로 z축을 조정합니다.
50마이크로미터 두께의 여러 조각을 자릅니다. 다음으로, 샘플 가장자리를 찾기 위해 이미징 영역을 주변 아가로스의 이미징을 최소화하면서 조직으로 제한합니다. PMT를 끈 후 레이저 파장을 800나노미터로 설정합니다.
레이저 스폿을 사용하여 스테이지를 이동하는 동안 조직 가장자리의 좌표를 찾습니다. 좌표를 확인한 후 레이저 스폿을 오른쪽 전면 중앙에 배치합니다. 이제 파장을 940나노미터로 변경합니다.
현미경 셔터를 자동 모드로 설정한 다음 셔터 전압을 V1의 경우 20, V2의 경우 1.71로 설정합니다. 3D 모자이크 설정 옵션을 눌러 스캔을 시작합니다. 이미징 후 물 탱크에서 조직 절편을 수집합니다. 타일 이미지를 스티칭하려면 먼저 단층 촬영 서버에서 Linux 컴퓨터로 데이터를 전송합니다.
MATLAB 스크립트 StepOneStitchingAndArchive를 엽니다. m을 클릭하고 원본 폴더를 찾습니다. 편집기 탭으로 전환하고 실행을 클릭합니다.
진행 상황 정보가 명령 창에 표시됩니다. 원본 폴더의 stitchedimages_100이라는 하위 폴더에서 연결된 이미지를 찾습니다. tar 명령을 사용하여 원시 데이터를 압축하고 파일 이름 확장자가 tar.bz2인 단일 파일로 저장합니다.
서포트 벡터 머신을 훈련시키려면 스티칭된 이미지를 미리 봅니다. Fiji가 있는 각 하위 폴더에서 동일한 파일 이름을 가진 하나의 이미지를 엽니다. 3개의 채널을 하나의 컬러 이미지로 병합한 다음 박테리아 및 조직 자가형광에서 명확한 신호가 보일 때까지 각 채널의 밝기를 조정합니다.
각 채널의 조정된 최대 강도 수준에 유의하십시오. 다음으로, MATLAB 스크립트 StepTwoSegmentationAndAnalysis.m을 엽니다. 학습을 위한 원본 폴더와 이미지 이름을 정의한 다음, Editor 탭으로 이동하여 Run을 클릭합니다.
색상 임계값을 묻는 대화 상자가 나타나면 이전에 Fiji에서 수동으로 확인한 값을 기반으로 한 값으로 채웁니다. 대화 상자에 따라 배경 영역과 관심 영역을 선택합니다. 모델이 얼마나 잘 훈련되었는지 보여주고 더 많은 지역을 추가해야 하는지 묻는 그래프가 나타납니다.
박테리아가 명확하게 분류될 수 있을 때까지 관심 영역과 배경을 더 추가합니다. 세그멘테이션 프로세스가 자동으로 실행되며 명령 창에서 진행 상황을 볼 수 있습니다. 다음으로, 콜라겐의 두 번째 조화 신호가 포함된 파란색 채널 이미지를 엽니다.
첫 번째 채널 영상을 x축과 y축에서 모두 10배로 구부리고 축소된 영상을 새 폴더에 저장합니다. 동일한 폴더 내에서 크기가 축소된 이미지를 세 번 복제합니다. 3D 시각화의 경우 아레나 보기에서 Imaris 시각화 소프트웨어 패키지를 실행합니다.
이제 IMS 또는 TIF 파일을 엽니다. 디스플레이 조정 창에서 다른 채널의 색상 표현을 조정합니다. Edit(편집) 메뉴에서 Image Properties(이미지 속성)를 클릭하여 최소값 또는 최대값과 감마 보정 값을 수동으로 설정합니다.
이미지의 모양을 조정한 후 스냅샷 도구를 사용하여 현재 뷰를 내보냅니다. 탐색 포인터를 사용하여 보기를 찾은 다음 더하기 추가를 사용하여 키 프레임을 추가합니다. 애니메이션 아이콘을 사용하여 3D 데이터를 동영상으로 표현할 수 있습니다.
빨간색 녹화 버튼을 눌러 동영상을 만든 다음 원하는 대상 폴더와 파일 형식에 저장합니다. 개별 살모넬라 세포는 비장, 간, 장간막 림프절 및 Peyer's patches와 같은 전체 마우스 장기에서 검출되었습니다. 형광 박테리아의 분할은 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의해 확인되었다.
숙주 세포는 관류 전에 표면 마커에 항체를 주입하여 생체내에서 염색하였다.
