단백질-리간드 복합체가 있는 시료를 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 준비된 용액 0.6ml를 5milL NMR 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. NMR 기기를 필요한 온도로 설정하려면 EDT 명령을 사용하여 온도 제어 모니터를 열고 원하는 온도를 조정하십시오.
그런 다음 샘플을 자동 시료 주입기에 놓습니다. 오토샘플러를 사용하여 샘플을 자석에 삽입하고 sx 명령을 실행한 다음 오토샘플러 트레이의 NMR 튜브 위치에 해당하는 위치 번호 N을 실행합니다. 그 후, 샘플은 NMR 자석에 들어갑니다.
용매 신호를 잠그려면 lock 명령을 입력하고 메뉴에서 적절한 용매를 선택합니다. 자동 모듈 atma 또는 수동 모듈 atmm을 사용하여 튜닝 및 일치 프로세스를 완료합니다. 이제 topshim 명령을 사용하여 자동 shimming을 시작한 다음 pulsecal 명령을 실행하여 proton 90도 펄스를 결정합니다.
그런 다음 새 데이터 세트를 만들고 STD NMR 펄스 시퀀스를 업로드합니다. ACQUPARS 창의 FQLIST 항목에서 STD NMR 실험에 대한 꺼짐 및 켜짐 공명 주파수를 정의합니다. 리간드 또는 단백질 양성자 신호가 없는 영역에서 꺼짐 공진 주파수를 설정합니다.
그런 다음, 글라이칸 신호가 없는 스펙트럼 영역에서 온 공명 주파수를 선택합니다. ASED 창의 ACQUPARS 매개변수에서 포화 시간 동안 사용할 모양의 펄스를 정의합니다. 그런 다음 양성자 90도 펄스 길이를 설정하고 총 포화 시간과 이완 지연을 3초로 조정합니다.
스캔 횟수를 8의 배수로 설정하고 더미 스캔을 8로 설정합니다. 그런 다음 F2의 포인트 수를 16K, 32K 또는 64K로 설정하고 F1을 2로 설정합니다. 이제 자동 명령 rga를 사용하여 오버플로를 방지하기 위해 수신기 게인을 설정합니다.
experiment 명령을 사용하여 총 실험 시간을 계산합니다. 마지막으로 zg 명령을 사용하여 수집을 위해 실험을 보냅니다. 실험이 끝나면 첫 번째 FID의 푸리에 변환을 수행하고 처리된 스펙트럼의 대상을 선택합니다.
그런 다음 lb 명령을 사용하여 선 확장 계수를 조정합니다. 스펙트럼을 수동으로 위상 조정하려면 process 탭에 액세스한 다음 adjust phase 하위 메뉴에 액세스하십시오. 해당 버튼을 클릭하고 드래그하여 0차 및 1차 보정을 수행하고 위상 결과를 저장합니다.
두 번째 실험에 대해 푸리에 변환을 수행한 후 처리된 스펙트럼을 다른 코드로 저장합니다. 여러 함수를 사용하여 처리된 두 스펙트럼을 불러오고, 다중 시각화에서 사용할 수 있는 빼기 버튼을 사용하여 뺍니다. 그런 다음 오프 공진 스펙트럼을 열고 MD 명령을 실행하여 다중 디스플레이 창을 시작합니다.
그런 다음 STD 스펙트럼을 업로드합니다. 다음으로, STD NMR 스펙트럼에 존재하는 신호의 주파수와 강도에 대한 비교 분석을 수행합니다. 오프 공진 실험에서 신호 강도를 측정합니다.
메뉴를 탐색하여 process(프로세스)를 선택한 다음 integrate(통합)를 선택합니다. 관심 영역을 신중하게 정의하고 적분을 파일에 기록합니다. 유사하게, STD NMR 실험에서 강도를 측정하여 동일한 매개변수가 사용되도록 하고 이러한 적분을 별도의 파일에 문서화합니다.
또는 STD와 오프 공명 스펙트럼 사이의 신호 강도를 비교하여 STD 값을 결정할 수 있습니다. 상대 STD를 백분율로 계산하려면 최대 STD 강도를 나타내는 양성자에 100% 값을 할당합니다. N-아세틸 유당 아민과 인간 갈렉틴 7의 상호 작용에 대한 양성자 STD NMR 스펙트럼은 결합을 나타내는 STD NMR 신호를 보여주었습니다.
더욱이, 단백질과 밀접하게 접촉한 양성자에 속하는 신호가 나타나 결합 항원결정기(binding epitope)를 묘사할 수 있었습니다.
