시작하려면 차가운 해부 매체가 들어있는 접시에서 강아지 척추의 요추 부위를 얻습니다. 해부 실체 현미경과 마이크로 가위를 사용하여 시상 축을 따라 척추를 자릅니다. 직선 핀셋을 사용하여 척추강에서 척수를 부드럽게 제거하고 척수(SC)의 고립된 요추 영역에서 수막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 분리된 SC 요추 부위를 10-15분 동안 차갑고 신선한 절개 배지에 옮기고 배양합니다.
플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 칼날에 수직으로 초퍼 기기의 절단 데크에 조직을 놓습니다. 잔류 절개 매체를 제거한 후 SC의 자동 절편을 진행합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 조각을 옮기고 35mm 접시에 15분 동안 신선한 해부 배지로 배양합니다. 배양 멤브레인 삽입체의 표면을 유기형 배지(OM)로 세 번 세척하고 멤브레인 삽입체 바닥에 1밀리리터의 배지를 남겨 둡니다.
dissection stereo microscope 아래에서 slices를 검사하고 조절된 membrane inserts에 원하는 수의 slices를 시드합니다. 슬라이스의 방향을 조정하고 과도한 배지를 제거한 후 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 인서트를 새 페트리 접시에 옮기고 멤브레인 인서트 바닥에 GDNF가 보충된 신선한 OM 1밀리리터를 추가합니다.
슬라이스를 섭씨 37도에서 배양합니다. ex vivo one 날에 기존 배지를 새 OM으로 교체합니다. 셋째 날에는 GDNF가 보충된 이식 배지로 전환하고 생체 외 7일째까지 매일 배지에 새로운 GDNF를 추가합니다. 나머지 장기 배양의 경우 배지가 변경될 때만 GDNF를 추가하십시오.
장기 배양된 마우스 SC 기관형 절편의 면역형광 분석에서 세포골격 마커인 신경필라멘트와 핵 뉴런 마커인 RBFOX3의 광범위한 분포가 밝혀져 건강한 상태와 뉴런 정체성을 입증했습니다.
