HEK 293 T 세포를 transfection하는 것으로 시작합니다. 형질주입 3일 후, 웰에서 배지를 제거하고 PBS로 한 번 세척합니다. 각 우물에 500마이크로리터의 트립신을 추가합니다.
섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 플레이트에서 모든 세포를 분리합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 완전한 DMEM 매체를 각 웰에 추가하고 세포를 재현탁시킵니다. 각 웰의 모든 세포를 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
그 때 실내 온도에 1, 000 g에 2 분 동안 분리기. 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 1밀리리터 PBS로 한 번 세척합니다. 다시 말하지만, 상층액을 조심스럽게 제거하고 500 마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다.
세포를 FACS 튜브로 옮깁니다. 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석합니다. 절제되지 않은 세포 현탁액을 로드합니다.
유세포 분석 워크시트에서 Acquire를 누르고 forward 및 side scatter voltages를 조정합니다. 중간 영역에 세포를 배치하려면 이 집단 R1 주위를 게이트하여 왼쪽 아래 사분면의 파편을 제외합니다. FL1, FL2 도트 블롯의 게이트를 G R1로 변경합니다. 쿼드 게이팅 도구를 선택하고 FL1/FL2 도트 블롯에서 셀 모집단의 오른쪽 상단 극단을 G R1로 클릭합니다. FL1/FL2 전압을 조정하여 셀을 왼쪽 하단 사분면에 배치합니다.
Pause and Abort를 누릅니다. 그런 다음 GFP 단색 제어 셀을 로드합니다. Acquire를 누르고 보정을 조정하여 GFP 양성 셀을 오른쪽 아래 사분면에 배치합니다.
Pause and Abort를 누릅니다. 다음으로 mCherry 단색 제어 셀을 로드합니다. Acquire를 누르고 보정을 조정하여 mCherry 양성 셀을 왼쪽 상단 사분면에 배치합니다.
Pause and Abort를 누릅니다. 메뉴 표시줄에서 Acquire를 클릭하고 Acquisition Storage를 선택합니다. 수집 기준에서 G1 R1 이벤트 중 10, 000개가 계산될 때 획득이 중지됨을 선택합니다.
Setup(설정)의 확인 표시를 취소합니다. 표본 셀을 불러옵니다. 획득을 누르고 10, 000 G1 R1 셀이 계산될 때까지 기다립니다.
다른 샘플과 대조군에 대해서도 동일한 작업을 반복합니다.
