시작하려면 모든 팩스 파일을 분석 대시보드로 가져옵니다. 파일 중 하나를 열어 전방 산점면 산점도 플롯을 확인합니다. 폴리곤 게이트를 구성하여 손상되지 않은 셀을 격리하고 플롯의 왼쪽 아래 모서리에 파편이 생기지 않도록 합니다.
부분모집단을 온전한 세포로 레이블을 지정하고 이 게이트를 모든 표본 막대로 끌어옵니다. 다음 샘플 단추를 사용하여 각 샘플에 대한 게이팅을 확인합니다. 음성 대조군 표본의 온전한 세포 부분모집단을 두 번 클릭하여 새 플롯을 표시합니다.
플롯 축을 X축의 FL1-H로 조정하여 GFP를 나타내고 Y축의 FL2-H를 mCherry를 나타냅니다. 그런 다음 쿼드 게이팅 도구를 선택하고 음의 세포 집단의 오른쪽 상단 극단을 클릭합니다. 네 개의 직사각형 게이트를 그대로 있는 셀 막대로 끕니다.
다음 샘플 버튼을 사용하여 올바른 게이팅을 위해 GFP 또는 mCherry 단일 색상 컨트롤의 각 샘플을 검사합니다. 레이아웃 편집기로 이동합니다. 여기에서 대표 플롯을 선택하고 레이아웃 편집기에 복사를 선택합니다.
모든 대표 플롯을 선택한 다음 두 번 클릭하여 그래프 정의를 엽니다. X축 레이블의 이름을 GFP로, Y축 레이블의 이름을 mCherry로 지정합니다. 동일한 플롯 내에서 GFP 양성 세포의 수를 mCherry 양성 세포의 수와 비교하여 상대적인 DNA 복구 효율성을 결정합니다.
NHEJ 및 HR 분석의 정확성을 보장하기 위해 적절한 보상 조정 및 게이팅 전략이 구현되었습니다. 이 전략은 GFP 양성 세포를 오른쪽 하단 사분면에 배치하고 mCherry 양성 세포를 왼쪽 상단 사분면에 배치했습니다. GFP 양성 세포의 비율은 DNA DSB 복구 및 transfection 효율성을 나타냈습니다.
반대로, mCherry 양성 세포의 비율은 transfection 효율만 반영했습니다. DNA DSB 복구 효율은 GFP 양성 대 mCherry 양성 세포의 비율로 계산되었습니다. 또한 shCONTROL 및 shWASH 세포에 대한 NHEJ 분석을 사용하여 DNA 복구에서 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질과 SCAR Humalog 또는 WASH 단백질의 역할을 입증했습니다.
WASH의 손실은 NHEJ 효율성을 감소시켜 NHEJ 홍보에 대한 WASH의 역할을 강조했습니다.
