먼저 효소 세포 분해 시약을 섭씨 37도에서 30분 동안 해동합니다. 10배 배율의 명시야 현미경으로 분화된 3차원 인간 장 오가노이드를 관찰하여 세포 건강을 보장합니다. 차별화된 오가노이드가 포함된 24웰 플레이트의 웰에서 500마이크로리터의 콜드 셀 회수 용액으로 매체를 교체합니다.
기저막에서 세포를 방출하기 위해 위아래로 피펫팅합니다. 셀 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 10분 동안 배양하고 5분마다 위아래로 피펫팅합니다.
400g의 셀 현탁액을 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 상층액을 제거합니다. 500 마이크로리터의 예열된 효소 세포 분해 시약에 펠릿을 재현탁시키고 위아래로 10회 피펫팅합니다.
오가노이드를 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 10분마다 P1000 피펫을 사용하여 전체 부피를 10회 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 세포 현탁액을 400g에서 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리하고 펠릿을 1mL의 분화 매체에 재현탁시킵니다.
얼음 위에서 세포를 위아래로 50회 빠르게 피펫팅하여 오가노이드를 단일 세포로 해리합니다. 70 미크론 팁 스트레이너를 통해 전체 부피를 여과하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 용출액을 수집합니다. 그런 다음 70 미크론 스트레이너를 통해 얻은 용리액을 40 미크론 팁 스트레이너에서 여과합니다.
5마이크로리터의 0.4% 트리판 블루를 5마이크로리터의 세포 현탁액에 첨가하고 트리판 블루 배제를 사용하여 생존 가능한 단일 세포를 계수합니다. 샘플을 세포 배양 배지로 희석하여 마이크로리터당 1000개의 세포를 얻습니다. 총 4,402개의 단일 세포를 분화된 회장 3차원 인간 장 오가노이드에서 분리했으며, 이는 흡수성 장세포 및 분비 세포를 포함한 예상 세포 유형을 나타냅니다.
