먼저 각질형성세포, 무혈청 배지(KSFM)에 담근 식도 생검 샘플을 채취합니다. KSFM을 Dispase I 1m리터로 교체하고 실온에서 10분 동안 생검을 배양합니다. 그 후, 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 생검이나 세포 파편 펠릿을 건드리지 않고 Dispase를 흡입합니다.
그런 다음 DPBS로 생검을 헹굽니다. 생검을 원심분리한 후 1, 000마이크로리터 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다. 다음으로, 500 마이크로리터의 트립신-EDTA를 생검에 추가하고 섭씨 37도에서 800rpm으로 흔들면서 10분 동안 배양합니다.
그런 다음 단일 셀 현탁액이 얻어질 때까지 반복적인 피펫팅을 수행합니다. 투베르쿨린 주사기의 고무 플런저 헤드를 사용하여 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다. 그 후, 2-4 밀리리터의 대두 트립신 억제제로 여과기를 세척하십시오.
다음으로, 5밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 스냅온 캡이 있는 35마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다. 세포 현탁액을 분리하기 후에, 1개, 000 마이크로리터 상층액을 흡인하기 위하여 피펫을 이용하십시오. 기저막 추출물 하이드로겔 매트릭스에 세포 펠릿을 재현탁시키고 예열된 현탁 세포 배양 플레이트에서 40마이크로리터 방울을 형성합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 20-30분 동안 배지 없이 플레이트를 배양하여 기저막 추출물 방울의 응고를 확인합니다. Y27632 마이크로몰 10개가 보충된 예열된 KSFM을 추가합니다. 9일째 되는 날에는 오가노이드 중앙에서 성장하는 케라틴화된 코어에서 양파 모양의 다층 구조가 관찰되었습니다.
