먼저, 1-2 밀리리터의 접착 방지 헹굼 용액을 15 밀리리터의 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다. 튜브를 소용돌이쳐 표면을 코팅합니다. 다음으로, 부착 방지 용액을 제거한 후 5ml의 DPBS 용액을 튜브에 피펫팅합니다.
필요할 때까지 코팅된 튜브의 캡을 씌웁니다. 인간 장 오가노이드 돔이 들어있는 플레이트의 모든 매체를 피펫팅합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 1밀리리터의 차가운 DMEM/F-12 배지를 돔에 직접 추가하여 플레이트에서 분리합니다.
다른 밀리리터의 배지를 피펫팅하여 남아 있는 오가노이드를 채취합니다. 현탁액을 코팅된 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 원하는 오가노이드 크기의 균일한 단편 현탁액이 생성될 때까지 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 분해합니다.
다음으로, 계수를 위해 현탁액의 부분 표본을 피펫팅합니다. 나머지 현탁액을 얼음 위에 놓습니다. 바닥이 평평한 96웰 플레이트의 각 웰 바닥에 XY 그리드를 그립니다.
50 마이크로리터의 DPBS를 웰에 피펫팅합니다. 5 마이크로 리터의 부분 표본을 각 웰에 옮깁니다. 직경이 50 - 200 마이크로미터인 오가노이드의 총 수를 수동으로 계산합니다.
그런 다음 주어진 방정식을 사용하여 오가노이드 현탁액의 부피를 계산합니다. 오가노이드를 계수한 후 나머지 덩어리 현탁액이 들어 있는 튜브에서 상층액과 흐림층을 제거합니다. 그런 다음 2ml의 차가운 DMEM/F-12를 펠릿에 직접 피펫팅합니다.
현탁액을 200G에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 동물 유래 시스템의 경우 40마이크로리터의 차가운 동물 유래 매트릭스 오가노이드 펠릿을 추가합니다. 오가노이드를 위아래로 피펫팅하여 매트릭스에 분배합니다.
매트릭스 오가노이드 혼합물을 미리 예열된 멸균 24웰 조직 배양 플레이트의 중앙으로 부드럽게 옮깁니다. 돔 겔화를 보장하기 위해 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 배양 전에 돔을 방해하지 않고 0.5ml의 따뜻한 장내 오가노이드 성장 배지를 웰 측면에 피펫팅합니다.
matrix four xeno-free 오가노이드 시스템의 경우 스페로이드 펠릿에 50마이크로리터의 3X 오가노이드 성장 매체를 추가합니다. 그런 다음 선택된 매트릭스 4개의 이종이 없는 오가노이드 100마이크로리터를 현탁액에 피펫팅합니다. 40마이크로리터의 하이드로겔 오가노이드 혼합물을 24웰 조직 배양 플레이트의 중앙에 추가합니다.
접시를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 웰 측면을 따라 0.5ml의 오가노이드 성장 배지를 피펫팅합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 이산화탄소 보충 5%와 습도 95%에서 접시를 다시 배양합니다.
