VOP(Vessels-on-a-Plate) 플랫폼의 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 내피화

먼저 동결 보존된 HUVEC 바이알을 37도의 수조에 2분 동안 담그십시오. 그런 다음 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 바이알을 헹굽니다. 5ml의 사전 예열된 ECGM을 15ml의 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다.

마이크로피펫을 사용하여 바이알에서 해동된 세포를 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 미리 데워진 신선한 배지 1m리터를 cryovial에 추가하여 내부를 헹구고 나머지 세포를 원추형 튜브로 옮깁니다. 상층액을 버린 후 10ml의 신선한 배지에 세포를 재현탁시킵니다.

그런 다음 세포를 T75 플라스크로 옮깁니다. 섭씨 37도의 가습된 이산화탄소 인큐베이터에서 플라스크를 배양합니다. 90% confluent HUVEC 세포를 T75 플라스크에 10ml의 DPBS로 헹굽니다.

그런 다음 플라스크에 0.25%TE의 1밀리리터를 추가합니다. 배양 후 플라스크의 측면을 가볍게 두드리고 트립신 중화 용액 5ml를 추가합니다. 그런 다음 세포를 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

5ml의 새 ECGM으로 나머지 세포를 수집하여 원추형 튜브로 옮깁니다. 이제 원추형 튜브를 250 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다. 상층액을 버린 후 세포 펠릿을 새 ECGM 1밀리리터에 재현탁시키고 세포를 계산합니다.

다시 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포를 90마이크로리터의 새 ECGM에 재현탁시킵니다. 다음으로, 판에 인쇄된 용기의 채널을 잠시 진공 흡입하여 루멘을 청소합니다. 마이크로피펫을 사용하여 채널에 15마이크로리터의 HUVEC 셀 현탁액을 부드럽게 로드합니다.

플레이트를 인큐베이터 안에 2시간 동안 평평하게 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 180도로 뒤집어 다음 두 시간 동안 평평한 위치를 유지합니다. 4시간 후 DPBS로 채널을 세척하여 부착되지 않은 세포와 죽은 세포를 제거합니다.

그런 다음 각 웰에 2ml의 새 ECGM을 피펫팅합니다. 다이나믹 컬처를 10도 기울기 각도와 5RPM으로 로커에 배치합니다. HUVEC 세포는 VOP의 혈관 채널의 내강 표면을 덮기 위해 빠르게 부착되고 증식했습니다.

내피의 성숙은 세포 파종 후 5일 후 CD31에 대한 면역염색을 통해 확인되었으며, 이는 긴밀한 접합부에서 CD31의 국소화를 입증했습니다.