시작하려면 5밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 70마이크로미터 여과기를 놓습니다. 그 위에 신경 세포 배지 500 마이크로 리터를 피펫팅합니다. 해리된 마우스 해마 조직 균질액을 여과기를 통해 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 1 밀리리터의 차가운 신경 세포 배지를 균질기에 두 번 피펫팅하여 헹굽니다. 이제 펠릿에 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 DPBS를 추가하여 재현탁시킵니다. DPBS로 현탁액의 부피를 1.5 밀리리터로 구성하십시오.
500 마이크로리터의 등장성 퍼콜 용액을 샘플에 피펫팅합니다. 원심분리기에 2ml의 차가운 DPBS를 용액을 오버레이합니다. 그런 다음 중간 단계에서 최상층과 미엘린 디스크를 흡인합니다.
다음으로, 4 밀리리터의 차가운 DPBS를 튜브에 넣고 원심 분리 한 후 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 고정 가능한 생존도 염색 용액에 세포를 재현탁시킵니다. 샘플을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하기 전에 1ml의 차가운 DPBS를 샘플에 피펫팅합니다.
상층액을 흡인한 후 100마이크로리터의 CD16, CD32 염색액을 추가합니다. 샘플을 5초 동안 소용돌이치게 한 다음 배양합니다. 배양 후 1mL의 FACS 완충액을 샘플과 원심분리기에 추가합니다.
염색 마스터 100 마이크로 리터를 피펫으로 튜브에 혼합합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 이제 이전과 같이 원심분리하기 전에 샘플에 FACS 완충액 1mL를 추가합니다.
상층액을 버린 후 펠릿을 250마이크로리터의 고정 완충액에 재현탁시킵니다. 다음으로, 튜브에 2mL의 투과화 완충액을 추가하고 다시 원심분리합니다. 펠릿에 100 마이크로 리터의 vGLUT1 염색 용액을 피펫팅합니다.
그런 다음 배양 및 원심 분리 전에 약 5 초 동안 혼합물을 소용돌이 치십시오. 세포 펠릿을 250 마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 마지막으로 40마이크로미터 필터를 통해 샘플을 필터링합니다.
isotype 대조군에 비해 해마 미세아교세포에서 더 높은 vGLUT1-PE 형광 신호가 관찰되었다. 더 높은 vGLUT1-PE 형광 신호는 후구의 미세아교세포에서 발견되었고, 소뇌에서는 해마에 비해 더 낮은 신호가 발견되었다. 가장 낮은 신호 강도는 비장 대식세포에서 감지되었습니다.
