시작하려면 해리된 쥐의 해마 조직이 들어 있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양합니다. 탁한 세포 현탁액을 새로운 15밀리리터 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 상층액을 버린 후, 세포 펠릿을 세척 혼합 용액 5mL에 재현탁시킵니다.
다음으로, 샘플을 70마이크로미터 필터를 통해 5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 통과시킨 후 다시 원심분리합니다. 샘플을 Percoll 그래디언트 원심분리한 다음 세포 펠릿을 100마이크로리터의 MACS 염색 완충액에 재현탁시키고 배양합니다. 이제 원심분리하기 전에 1mL의 MACS 버퍼를 샘플에 피펫팅합니다.
그런 다음 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 MACS 완충액에 현탁시킵니다. 다음으로, 자기 분리기의 포지티브 선택 컬럼을 3ml의 MACS 버퍼로 헹굽니다. 500 마이크로리터의 셀 현탁액을 컬럼에 부드럽게 적용합니다.
MACS 버퍼로 컬럼을 세 번 세척한 후 컬럼을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 놓습니다. 컬럼에 5ml의 MACS 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 샘플을 300g에서 10분 동안 원심분리한 다음 1ml의 예열된 DMEM을 펠릿에 추가합니다.
최종 셀 현탁액 500마이크로리터를 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 각 웰의 250마이크로리터를 미리 따뜻해진 새 DMEM으로 교체합니다. 그런 다음 배지 위에 3마이크로그램의 pHrodo Red 라벨 시냅토솜을 추가합니다.
동일한 부피의 라벨링되지 않은 시냅토솜을 음성 대조군에 추가합니다. 배양 후 차가운 DPBS로 우물을 씻으십시오. 이제 각 웰에 200마이크로리터의 트립신-EDTA를 피펫팅합니다.
35초 배양 후 FBS가 포함된 DPBS 1밀리리터를 각 웰에 피펫팅합니다. 셀 현탁액을 여과기를 통해 5밀리리터의 폴리프로필렌 튜브로 옮긴 다음 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 DPBS로 각 제품을 두 번 잘 세척합니다. 원심분리기는 500g에서 5분 동안 샘플을 수집했습니다.
그런 다음 염색 용액 100 마이크로 리터에 세포를 얼음 위에서 10 분 동안 배양합니다. 다음으로, CD11b 및 CD45를 염색 용액에 첨가하여 최종 농도를 1에서 100 사이로 만듭니다. 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 샘플을 배양합니다.
1mL의 FACS 버퍼를 샘플에 피펫팅한 다음 유세포 분석 전에 300g에서 10분 동안 최종 원심분리를 실시합니다. pH 4에서 시냅토솜에서 얻은 것과 유사한 양성 PE 형광이 CD11b 양성 및 CD45 양성 미세아교세포에서 관찰되었습니다.
