phiC31 Integrase Mediated Embryo Transgenesis를 위한 초파리 배아의 미세주입

먼저 붓으로 탈염화 된 초파리 배아를 포도 한천의 긴 스트립에 옮깁니다. 해부 바늘을 사용하여 스트립의 가장자리를 따라 약 60개의 배아를 선으로 하여 뒤쪽이 바깥쪽을 향하게 합니다. 이제 18mm 길이의 양면 테이프를 커버 슬립의 가장자리를 따라 세로로 붙입니다.

뒷면을 제거한 후 커버 슬립을 정렬된 배아에 부드럽게 누르고 배아가 있는 커버 슬립을 건조제가 들어 있는 상자에 옮깁니다. 그 위에 후광 카본 오일을 추가하십시오. 배아를 미세 주사하려면 먼저 펴진 피펫을 사용하여 2마이크로리터의 DNA를 바늘에 로드합니다.

헤일로 카본 오일로 정렬된 배아를 도립 현미경 아래에 놓습니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 배아의 뒤쪽 끝에 삽입합니다. 풋 컨트롤을 사용하여 DNA를 배아에 조심스럽게 주입합니다.

첫 번째 배아의 미세 주입 완료 후 바늘을 제거한 다음 다음 배아의 뒤쪽 끝으로 이동합니다. 주입된 배아를 배양을 위해 한천 플레이트에 옮깁니다. 알이 부화하면 음식이 담긴 유리병을 준비합니다.

바이알에 증류수 몇 방울을 추가합니다. 실체 현미경과 붓을 사용하여 부화한 유충을 모은 다음 바이알에 옮깁니다. 바이알을 섭씨 25도에서 50%에서 60%의 습도 아래에서 10일 동안 배양합니다.

과도하게 건조된 배아는 기형으로 보이며 미세주입에 사용할 수 없습니다. 덜 건조된 배아는 구멍을 뚫었을 때 많은 양의 세포질이 누출되어 생존율을 떨어뜨렸습니다. 적절하게 건조된 배아는 주입되었을 때 소량만 누출되었습니다.

배아 미세주입에 사용되는 phiC31 인테그라제를 발현하는 초파리 계통은 흰 눈을 가지고 있었습니다. 이 유전자형의 늙은 파리는 눈에 특이적으로 발현되는 적색 형광 단백질이 축적되어 분홍색 눈을 가지고 있습니다. attP2 도킹 부위에서 주황색 눈을 가진 형질전환 유전자를 가진 형질전환 파리가 성공적으로 생산되었습니다.