마우스에서 LCMV 특이적 여포 도우미 T 세포의 초기 발달 매핑

먼저, 6-8주 된 CD 45.1 양성 SMARTA 마우스를 구하여 100마이크로리터의 RPMI 배지에 200마이크로그램의 LCMV GP 61-77 펩타이드를 정맥 주사합니다. 마우스에서 비장 세포를 얻은 후 2% RPMI로 현탁시켜 밀리리터당 eighT-cells의 1배 10의 세포 밀도를 달성하고 세포가 있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 50 마이크로리터의 세포 현탁액과 150 마이크로리터의 염색 완충액을 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다.

96웰 플레이트를 800G에서 섭씨 4도에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 플레이트를 소용돌이치게 하고 각 웰에 200마이크로리터의 염색 완충액을 추가합니다. 세포를 펠릿화한 후 표면 항체 칵테일로 얼음에 묻혀 어두운 곳에서 30분 동안 재현탁하고 배양합니다.

두 번 세척한 후 200 마이크로리터의 염색 완충액에 세포를 재현탁시키고 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석을 수행하여 SMARTA CD4 양성 T 세포의 활성화 상태를 확인합니다. 그런 다음 웰당 6개의 SMARTA CD4 양성 T 세포를 10번 10번 씨를 24웰 플레이트에 넣습니다.

섭씨 4도에서 3분 동안 800G의 세포를 회전시키고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 1mL의 레트로바이러스 배지와 8마이크로그램의 폴리브렌을 추가합니다. 스핀은 섭씨 37도에서 2시간 동안 800G에서 세포를 형질주입합니다.

레트로바이러스 배지를 폐기한 후 인터루킨 2가 보충된 예열된 10%RPMI 1mL로 세포를 배양합니다. 셀 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 옮기고 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 2%RPMI로 셀을 재현탁하여 밀리리터당 10배에서 8번째 셀의 셀 밀도를 달성합니다.

형질도입 효율을 평가하기 위해 50마이크로리터의 세포 현탁액을 둥근 바닥 96웰 플레이트에 분양합니다. CD4, V alpha two 및 vector tag-associated antibody를 포함한 표면 항체 칵테일과 함께 얼음 위에서 배양합니다. 세포를 세척하고 앞서 설명한 대로 유세포 분석을 수행합니다.

그런 다음 C57BL/6 수용 마우스에 6개의 CD 45.1 양성 SMARTA CD4 양성 T 세포 중 10배를 1회 주입한 후 다음 날 LCMV Armstrong의 6개 플라크 형성 단위에 10배를 주입합니다. 쥐에서 비장 세포를 얻은 후 원하는 마커를 확인하기 위해 염색합니다. 전사 인자를 검출하려면 어두운 곳에서 20분 동안 실온에서 200마이크로리터의 2% 파라포름알데히드로 세포를 배양합니다.

마지막으로, 초기 급성 LCMV 감염 단계에서 요인을 검출하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 감염 후 3일째 되는 날, MIGR1 SMARTA CD4 양성 T세포 중 여포 도우미 T 세포와 T-도우미 1 세포의 균형 잡힌 분기가 발견되었습니다. MIGR1, BCL6, SMARTA, CD4 양성 T 세포에서 우세한 여포 도우미 T 세포 지시 분화 및 향상된 BCL6 발현 수준이 관찰되었습니다.