먼저, 면역염색된 간세포암 절편의 이미지를 획득합니다. QuPath 0.4.3을 다운로드하여 엽니다. exe 파일을 엽니다.
QuPath 프로젝트를 구성하는 데 적합한 이름으로 새 폴더를 만듭니다. 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 프로젝트 생성 버튼을 클릭하고 새로 생성된 폴더를 선택합니다. 그런 다음 스캔한 이미지를 QuPath 소프트웨어 창으로 드래그합니다.
새 창이 나타나면 이미지 유형 설정을 선택하고 H-DAB를 클릭한 다음 가져오기를 클릭합니다. 가져온 이미지를 보려면 메뉴의 왼쪽 창에 있는 목록을 확인하고 이미지를 두 번 클릭하여 엽니다. 메인 메뉴에서 파일을 선택하고 이미지를 프로젝트로 저장합니다.
메인 메뉴에서 브러시 또는 지팡이 도구를 선택하여 종양 영역에 주석을 달 수 있습니다. 불연속적인 종양 영역의 경우 각 영역에 개별적으로 주석을 추가합니다. 제어 키를 누른 상태에서 모든 영역을 선택합니다.
그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 여러 항목 편집을 선택하고 선택한 항목 병합을 선택합니다. 그런 다음 메인 메뉴에서 자동화를 클릭하고 스크립트 편집기 표시를 선택합니다. 필요한 스크립트를 복사하여 스크립트 편집기에 붙여넣은 다음 실행을 클릭합니다.
또는 주 메뉴에서 폴리라인 도구를 선택하여 악성 세포 둥지와 인접한 비종양 조직을 분리하는 경계를 정확하게 그립니다. 그런 다음 주 메뉴에서 테두리를 선택하고, 객체를 선택하고, 주석을 클릭하고, 주석 확장을 선택합니다. 확장 반경을 500마이크로미터로 설정하고 선 캡에 대해 flat을 선택합니다.
내부를 활성화하고, 제거하고, 상위에 대한 제한이 활성화되어 있는지 확인합니다. 이제 새로 생성된 주석을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 단일 편집을 선택하고 분할을 선택합니다.
주석이 달린 영역의 이름을 올바르게 지정하려면 왼쪽 목록에서 주석을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 세트 속성을 선택하고 내부 및 외부 여백 영역에 적절한 이름을 입력합니다. 나머지 종양 영역을 종양 센터로 정의합니다.
앞에서 설명한 것처럼 바깥쪽 가장자리에 인접한 500마이크로미터 너비의 종양 주변 영역을 확장합니다. 자세한 픽셀 분석을 위해 주 메뉴에서 사각형 도구를 선택합니다. 그런 다음 구별할 모든 픽셀 유형을 포함하는 영역에 주석을 추가합니다.
그런 다음 주 메뉴로 이동합니다. 분석을 선택하고 전처리를 클릭합니다. 그런 다음 염색 벡터 추정을 클릭합니다.
시각적 염색 편집기를 활성화한 후 자동을 선택하고 확인을 클릭합니다. 추정된 염색 벡터의 이름을 H-DAB로 지정합니다. 픽셀 분석의 경우 다른 방법은 메인 메뉴의 사각형 도구를 사용하여 hematoxylin으로 염색된 핵의 작은 부분을 강조하는 것입니다.
그런 다음 왼쪽 메뉴에 액세스하여 이미지를 선택합니다. 그런 다음 stain one을 두 번 클릭하고 예를 선택합니다. 다시 말하지만, 사각형 도구를 사용하여 작은 영역에 주석을 달아 DAB로 양성 염색을 표시합니다.
그런 다음 왼쪽 메뉴에서 이미지를 선택하고 얼룩 2를 두 번 클릭한 다음 예를 클릭합니다. 메인 메뉴에서 양성 면역 세포의 면적 분율을 평가하려면 classify 옵션을 클릭하고 pixel classification을 선택한 다음 create thresholder를 클릭합니다. 그런 다음 해상도를 높게 설정하고 DAB 채널을 선택한 다음 시그마가 0.5인 가우시안 프리 필터를 적용합니다.
임계값을 0.2에서 0.3 사이로 조정합니다. 임계값 이상의 픽셀은 양수로, 임계값 미만의 픽셀은 음수로 정의합니다. 지역 선택의 경우 주석을 선택합니다.
분류자에 이름을 지정합니다. 그런 다음 저장, 측정 및 확인을 클릭합니다. 결과를 문서화하려면 왼쪽 메뉴에 표시된 결과를 복사하여 스프레드시트로 전송합니다.
다른 방법으로 상단 메인 메뉴에서 측정을 선택합니다. 그런 다음 주석 측정 표시를 선택합니다. 클립보드에 복사를 선택하고 이 결과를 스프레드시트에 붙여넣어 자세한 기록을 만듭니다.
마지막으로 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 멀티뷰로 이동한 다음 뷰어 닫기를 클릭하여 이미지를 닫습니다. CD117 단백질은 종양, 기질 및 혈관 주위 공간에 있는 둥근 세포의 세포질막에서 주로 관찰되었습니다. CD117 양성 세포는 종양 캡슐 및 외측 가장자리 및 주위 종양의 혈관 주위 영역에서도 관찰되었습니다.
NKp46 단백질은 주로 정현파와 같은 공간, 종양 중심의 기질 및 내부 가장자리에 있는 둥근 세포의 세포질막에서 관찰되었습니다. Nkp46 양성 세포는 종양 둥지 주변의 캡슐과 바깥쪽 가장자리 및 종양 주위 영역의 문맥 기질에서 관찰되었습니다. CD1a 단백질은 주로 둥근 세포의 세포질막에서 관찰되었으며, 종양 중심 및 내부 가장자리 영역의 기질 및 정현파와 같은 공간에 흩어져 있거나 응집되어 있었습니다.
CD1a 양성 세포는 paratumor 영역의 정현파 및 담도 상피에서 발견되었습니다.
