GFP의 subcellular 지방화를 관찰하기 위하여는, Nicotiana benthamiana의 groinfiltration의 48 시간 후에, 편평한 잎을 선정하고 구멍 펀치를 사용하여 6 밀리미터 구멍을 만드십시오. 30% 자당 용액을 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다. 잎 샘플을 뒷면이 위를 향하도록 놓고 커버 유리로 덮습니다.
아그로인 침윤 후 3일에 재조합 GFP를 발현하는 온전하고 신선한 N.benthamiana 잎을 수집하고 잎의 무게를 잰다. 잎 잎을 사전 냉각되고 멸균된 이중 증류수로 헹구어 이물질을 제거합니다. 1, 000 밀리리터 넓 입 비커에 있는 500 밀리리터의 미리 냉각된 100 밀리몰 인산염 완충액에 있는 abaxial 면이 아래로 향하게 한 상태에서 20 그램을 담그십시오.
100 메쉬 나일론, 가는 메쉬 실, 플라스틱 판으로 잎을 덮습니다. 비커를 진공 펌프에 연결합니다. 0.8메가파스칼 진공을 1분 동안 적용한 다음 빠르게 대기압으로 복원합니다.
완충액에서 잎을 제거하고 흡수성 종이로 부드럽게 물기를 닦아냅니다. 잎을 말아서 망사로 감쌉니다. 아포플라스틱 세척액(AWF)을 수집하려면 튜브 캡으로 고정된 메쉬 실을 사용하여 50밀리리터 원심분리기 튜브에 롤링 잎을 끝이 위로 향하게 놓습니다.
잎을 500g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 잎을 제거하고 피펫을 사용하여 AWF를 수집합니다. 니켈 세파로스 엑셀 수지를 단백질 추출물 부피에 비해 1:1, 000 비율로 튜브에 추가합니다.
니켈 수지를 이중 증류수와 인산염 완충액의 수지 부피의 10배로 차례로 따로 3회 세척합니다. 단백질 추출물을 니켈 수지와 함께 2시간 동안 배양하여 완전히 결합할 수 있도록 합니다. 그런 다음 500g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 상층액에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.
인산염 완충액 수지 부피의 20배로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 GFP를 용리하기 위해 250 밀리몰 이미다졸의 수지 부피의 10배를 추가합니다. 혼합물을 500g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다.
웨스턴 블롯 분석은 N.benthamiana에서 30 킬로달톤 재조합 단백질 GFPs의 일시적인 발현을 확인했습니다. 형광 현미경 검사는 apoplast 내에 GFPs의 존재를 설명했습니다. 진공 침투 원심분리로 추출된 AWF 단백질에도 GFP가 포함되어 있습니다.
테스트된 8가지 추출 용액 중에서 인산염 완충액은 가장 많은 양의 AWF 및 GFP를 추출했습니다. 다양한 pH에서 인산염 완충액을 비교한 결과 중성 및 약알칼리성 조건에서 AWF 및 GFP 추출이 개선된 것으로 나타났습니다. 또한, 100 밀리몰 인산염 완충액은 AWF 및 GFP를 회수하는 데 최대 효능을 보였습니다.
100밀리몰 인산염 완충액을 사용하여 신선한 잎 1g당 495마이크로그램의 총 AWF 단백질을 아포플라스트에서 회수했습니다. 추출된 AWF는 총 녹는 단백질에 있는 GFPs의 대략 18%s에 대응한 GFPs의 10 마이크로그램을 포함했다. 니켈 친화성 착색인쇄기 다음, GFPs' 순수성은 총 녹는 단백질 적출을 통해 달성된 44.9%s 순수성 보다는 실질적으로 더 높은 AWF 적출에서 84.3%를 도달했습니다.
