시작하려면 실험용 암컷 마우스를 작업 플랫폼에 놓습니다. 복강 내로, 첫날 오후 8:00 경에 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 7.5 국제 단위를 투여합니다. 48시간 후, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 7.5 국제 단위의 인간 융모성 성선 자극 호르몬을 복강 내 주사합니다.
세포 배양 접시 뚜껑을 상반부와 하반부로 나눕니다. 위쪽 절반에는 정자 배치를 위해 PVP 각각 5 마이크로 리터의 4-6 방울을 놓습니다. ICSI 절차를 위해 하반부에 각각 5 마이크로 리터의 M2 배지 8-10 방울을 첨가하십시오.
PVP 및 M2 중간 방울을 약 3ml의 미네랄 오일로 덮습니다. 안락사된 수컷 쥐에서 부고환 카우다를 분리한 후 멸균된 거즈에 부드럽게 닦아냅니다. 부고환을 잘라내고 집게를 사용하여 정자를 방출하고 미리 평형을 이룬 인간 난관에 정자를 수집하여 부드럽게 짜냅니다.
미리 따뜻해진 인간 난관 유체 배지에서 cauda 부고환을 헹굽니다. 튜브를 덮지 않은 상태로 섭씨 37도에 놓고 정자 정전 용량을 위해 5% 이산화탄소 인큐베이터를 놓습니다. 인간 융모성 성선 자극 호르몬을 주입한 후 4일째 되는 날, 안락사된 암컷 쥐를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
25게이지 바늘을 사용하여 난관의 양풀라를 찢어 수많은 적운 난모세포 복합체를 방출합니다. 용량 화 후 100 마이크로 리터의 정자를 5 초 동안 초음파 처리하여 머리와 꼬리를 분리합니다. micromanipulation 바늘에 사용 유체를 채우고 채워진 부분이 바늘 내부로 0.5cm를 측정하도록 합니다.
마이크로 매니퓰레이터의 오른쪽 팔에 바늘을 설치하고 홀딩 캡을 조여 고정합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터의 왼쪽 팔에 피펫을 고정하는 납작한 팁 micromanipulation을 설치합니다. 주입 바늘과 고정 피펫을 현미경의 시야에 놓습니다.
편광 현미경으로 난모세포 내 중기 방추체의 위치를 결정하여 방추체 장치가 주입 쪽에 있지 않은지 확인합니다. 주사 바늘이 zona pellucida와 접촉하면 강도 5와 주파수 1로 Piezo 펄스를 활성화하여 zona pellucida에 천공을 만들고 주사 바늘이 통과할 수 있도록 합니다. 강도 1과 주파수 1의 피에조 펄스를 사용하여 원형질막에 작은 기공을 만들어 정자 머리가 난자형질에 주입되도록 합니다.
비외상성 겸자를 사용하여 마취된 가짜 임신 암컷 쥐의 난소, 난관 및 자궁을 조심스럽게 외부화합니다. 주사기 바늘 끝을 사용하여 자궁 난관 접합부 아래의 자궁 벽을 위쪽으로 약간 절개하여 혈관을 피합니다. 작은 구멍을 통해 2-3 밀리미터의 난관을 부드럽게 삽입하십시오.
ICSI 방법을 사용하여 마우스에서 89.57%의 수정률을 달성했으며, 접합체의 87.38%가 ICSI 후 24시간 이내에 2세포 배아 단계로 진행되었습니다. 배아 이식 후 살아있는 새끼의 출생률은 42.5%로 관찰되었으며, 자연적으로 태어난 마우스와 ICSI 마우스 간에 무작위 혈당 수치에는 큰 변동이 없었습니다. 그러나 수컷 ICSI 마우스는 지속적으로 높은 공복 혈당 수치를 보였으며, 이는 포도당 항상성 장애를 시사합니다.
포도당 내성 검사에서 수컷 ICSI와 대조군 마우스 간에 혈당 수치의 유의한 차이가 관찰된 반면 암컷 마우스에서는 차이가 관찰되지 않았습니다. 체중 추적에서 수컷 및 암컷 ICSI 마우스 모두 대조군에 비해 과체중 표현형을 나타냈습니다.
