시작하려면 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포 바이알을 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 해동이 완료되면 PBMC 현탁액을 9ml의 TGM이 포함된 15ml의 튜브로 옮깁니다. 카운팅을 위해 세포 현탁액의 부분 표본을 피펫팅한 후 300G에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
펠릿화된 PBMC를 TGM 3밀리리터에 재현탁시킵니다. 그런 다음 필요한 부피의 셀 현탁액을 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 소생술 전날, 100 마이크로리터의 마우스 면역글로불린 G 마그네틱 비드를 1.5 밀리리터의 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
튜브에 1밀리리터 PBS를 추가하고 마그네틱 스탠드에 올려 비드를 세척합니다. PBS 100 마이크로리터에 비드를 재현탁시킵니다. 그런 다음 현탁액에 항체를 추가합니다.
피펫을 사용하여 서스펜션을 부드럽게 잘 섞습니다. 밤새 섭씨 4도의 로커에 서스펜션을 놓습니다. 이전에 한 것처럼 PBS에서 비드를 세척한 후 100 마이크로 리터의 PBS에 재현탁시킵니다.
이제 NHCD3 hCD28 코팅 면역 비드를 플레이트에 추가하고 배양합니다. 48시간 배양 후 세포 현탁액을 혼합하여 15mL 원심분리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 3분 동안 놓습니다.
그런 다음 상층액을 새로운 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 300 마이크로 리터의 TGM에 5 PBMC의 거듭 제곱으로 5 곱하기 10을 48 웰 평판의 웰에 파종합니다. 200 마이크로리터의 렌티바이러스 스톡을 해당 웰에 피펫팅합니다.
그런 다음 원심분리하기 전에 프로타민 설페이트를 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도로 첨가합니다. 각 웰에서 300마이크로리터의 상층액을 피펫팅한 다음 각 웰에 1밀리리터의 신선한 TGM을 추가합니다. 이산화탄소 5% 미만인 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
2-3일마다 0.5-2밀리리터의 신선한 TGM을 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 세포를 12웰 플레이트로 옮긴 다음 총 세포 밀도가 4밀리리터 부피로 600만 개에 도달할 때까지 6웰 플레이트로 옮깁니다.